伍冬梅，李春鳴

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 組織胚胎學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

腫瘤是危害人類健康的大患，它的發(fā)生是多因素、多步驟的病理過程[1]，其本質(zhì)上可能是細(xì)胞原癌基因的激活和抑癌基因的失活造成的，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。近年來，生命科學(xué)研究的領(lǐng)域中，細(xì)胞凋亡與癌變關(guān)系的研究一直是研究的熱點(diǎn)，本課題通過對胃癌及胃癌前病變中細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因Bcl-2、Bax表達(dá)情況的觀察，進(jìn)一步探討胃癌發(fā)生的可能分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 選取我院2005年1月至2009年1月病理科胃黏膜活檢及手術(shù)標(biāo)本共150例，正常胃黏膜10例，慢性萎縮性胃炎伴腸化生60例，異型增生30例，胃癌50例。所有標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，制備4 μm切片。兔抗人Bcl-2多克隆抗體、兔抗人Bax多克隆抗體、免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、TUNEL凋亡試劑盒購于武漢博士德生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)SP法檢測Bcl-2蛋白、Bax蛋白 石蠟切片脫蠟至水，3%過氧化氫室溫10 min以滅活內(nèi)源性酶，微波修復(fù)抗原，滴加封閉液室溫10 min，滴加一抗及生物素化二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片。第一抗體原液按1∶100稀釋，以PBS代替一抗作為陰性對照。光鏡下觀察結(jié)果，Bcl-2、Bax蛋白陽性信號為細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色。

1.2.2 TUNEL技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 石蠟切片脫蠟至水，蛋白酶K消化10 min，滴加封閉液室溫30 min，滴加TUNEL反應(yīng)混合液60 min，DAB顯色、封片后光鏡下觀察結(jié)果，細(xì)胞核呈棕黃色。顯微鏡下選5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野100個(gè)細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI值)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/計(jì)算細(xì)胞總數(shù))×100%。

2 結(jié)果

2.1 胃癌及胃癌前病變組織中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況 Bcl-2、Bax蛋白在慢性萎縮性胃炎伴腸化生、異型增生及胃癌組織中均有表達(dá)(見圖1～2)。慢性萎縮性胃炎伴腸化生、異型增生、胃癌中Bcl-2蛋白表達(dá)陽性率與正常胃黏膜對比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，慢性萎縮性胃炎伴腸化生Bcl-2蛋白表達(dá)陽性率與異型增生對比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。胃癌前病變Bax蛋白陽性率與胃癌組織對比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01 ，P<0.05，見表1)，慢性萎縮性胃炎伴腸化生Bax蛋白表達(dá)陽性率與異型增生對比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注：A:異型增生；B：胃癌組織。圖1 Bcl-2蛋白在異型增生及胃癌組織中的表達(dá)(SP，×400)

注：A:異型增生；B：胃癌組織。圖2 Bax蛋白在異型增生及胃癌組織中的表達(dá)(SP，×400)

表1胃癌、胃癌前病變中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況

組別例數(shù)Bcl-2陽性率(%)Bax陽性率(%)正常胃黏膜100.0(0/10)10.0(1/10)腸化生6031.7(19/60)a55.0(33/60)b異型增生3043.3(13/30)a30.0(9/30)c胃癌5062.0(31/50)a12.0(6/50)

注：與正常胃黏膜比較，aP<0.01，與胃癌比較，bP<0.01，cP<0.05。

2.2 胃癌及胃癌前病變組織細(xì)胞凋亡情況 TUNEL染色陽性反應(yīng)物質(zhì)為棕黃色，位于細(xì)胞核，凋亡細(xì)胞呈簇狀分布或單個(gè)散在分布。Bcl-2蛋白表達(dá)陽性腸化生、異型增生和胃癌中凋亡細(xì)胞指數(shù)顯著低于Bcl-2蛋白陰性組(P<0.05，見表2)，經(jīng)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，Bcl-2蛋白表達(dá)陽性率與AI值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.915,P<0.01)。Bax蛋白表達(dá)陽性組中凋亡細(xì)胞指數(shù)顯著高于Bax蛋白陰性組(P<0.05，見表3)，Bax蛋白表達(dá)陽性率與AI值呈正相關(guān)(r=0.879，P<0.01)。

表2胃癌、胃癌前病變中Bcl-2蛋白表達(dá)與細(xì)胞凋亡的關(guān)系

組別 Bcl-2陽性組例數(shù) AI(%) Bcl-2陰性組例數(shù) AI(%)腸化生196.34±0.96a419.96±1.43異型增生134.98±1.03a176.85±2.25胃癌311.04±1.09a193.96±2.11

注：與Bcl-2陰性組比較，aP<0.05。

表3胃癌、胃癌前病變中Bax蛋白表達(dá)與細(xì)胞凋亡的關(guān)系

組別 Bax陽性組例數(shù)AI(%) Bax陰性組例數(shù) AI(%)腸化生3310.76±1.17a277.17±2.26異型增生97.75±1.77a213.84±0.70胃癌64.63±2.18a441.52±1.22

注：與Bax陰性組比較，aP<0.05。

3 討論

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，但其機(jī)制尚未明確。胃癌的發(fā)生很少直接從正常胃黏膜上皮產(chǎn)生，在癌變之前多經(jīng)歷一段相當(dāng)長的演變過程，胃黏膜異型增生和腸化生認(rèn)為是胃癌前病變[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，胃黏膜癌變過程中不僅存在活躍的細(xì)胞增生，而且存在細(xì)胞凋亡的異常[3]。Bcl-2基因是凋亡調(diào)控中起關(guān)鍵作用的基因，是保護(hù)細(xì)胞免受凋亡的重要凋亡抑制基因之一[4]。Bax與Bcl-2在細(xì)胞內(nèi)可形成二聚體，Bax的過表達(dá)可拮抗Bcl-2的保護(hù)效應(yīng)而使細(xì)胞趨于凋亡，是重要的凋亡誘導(dǎo)基因之一[5]。

胃黏膜癌變的啟動(dòng)階段可能存在活躍的細(xì)胞增殖和大量細(xì)胞凋亡共存的現(xiàn)象，而推進(jìn)階段則可能以細(xì)胞增殖為主，細(xì)胞凋亡退居其次。細(xì)胞過度增殖和(或)細(xì)胞凋亡減少是胃癌發(fā)生的生物學(xué)基礎(chǔ)[6]。王琳等[7]研究發(fā)現(xiàn)由正常胃黏膜至胃癌前病變及胃癌的演變過程中，Bcl-2對細(xì)胞凋亡有明顯的負(fù)調(diào)節(jié)作用。Bax具有抑制Bcl-2促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。Bcl-2與Bax兩者之間的比例決定了細(xì)胞的命運(yùn)，若Bax占多數(shù)則Bcl-2被抑制，凋亡被誘導(dǎo)；反之細(xì)胞得以生存。本實(shí)驗(yàn)用免疫組化法檢測Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示：胃癌前病變到胃癌的過程中，Bcl-2蛋白表達(dá)陽性率逐漸增加，Bax蛋白表達(dá)陽性率則逐漸減少，Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)陽性率之比逐漸增加，說明Bcl-2蛋白具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，Bax蛋白具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，Bcl-2蛋白表達(dá)增加及Bax表達(dá)減少可能是胃癌發(fā)病中細(xì)胞凋亡受抑制的主要機(jī)制之一，胃癌的發(fā)生可能與細(xì)胞凋亡受抑制有關(guān)。

此外，本實(shí)驗(yàn)采用TUNEL技術(shù)檢測了正常胃黏膜、慢性萎縮性胃炎伴腸化生、異型增生及胃癌中細(xì)胞凋亡的情況，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中AI值低于癌前病變組織AI值，即從慢性萎縮性胃炎伴腸化生、異型增生到胃癌的發(fā)展過程中AI值逐漸下降，表明胃黏膜發(fā)生癌變過程中可能存在細(xì)胞凋亡受抑制。在此過程中Bcl-2蛋白表達(dá)增加，且Bcl-2蛋白表達(dá)陽性率與AI值呈負(fù)相關(guān)，表明Bcl-2參與了對胃黏膜細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的調(diào)控，對凋亡具有抑制性調(diào)控作用。Bax蛋白表達(dá)陽性率與AI值呈正相關(guān)，表明Bax促進(jìn)了胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡的過程，胃黏膜上皮細(xì)胞增殖與凋亡之間的平衡失調(diào)，可能是最終導(dǎo)致胃癌發(fā)生的分子基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

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[4] 劉展,張明亮,張俐,等.胃癌及癌前病變中的細(xì)胞凋亡與Bcl-2蛋白、P糖蛋白的表達(dá)及相關(guān)性研究[J].南華大學(xué)學(xué)報(bào),2002,30(2):105-107.

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[6] 劉海峰,劉為紋,王國安,等.胃癌組織bcl-2基因表達(dá)與細(xì)胞凋亡和增生的關(guān)系[J].世界華人消化雜志,2004,12(15):2543-2546.

[7] 王琳,曹永成,牛愛軍,等.胃癌組織中bcl-2、Bax、p16和p53蛋白的表達(dá)和意義[J].分子診斷與治療雜志,2012,4(6):397-399.