趙麒麟， 陳 靜，羅軍敏，鄭 靜，秦娜琳，陳富超

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 第一臨床學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)2009級學(xué)生，貴州 遵義 563099;2.遵義醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

ALI是多種細(xì)胞因子參與的炎癥反應(yīng)性疾病，其中TNF-α等促炎因子過度表達(dá)、IL-10等抗炎因子相對不足在ALI發(fā)生發(fā)展中起重要作用。若不能積極治療，當(dāng)ALI發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)時其病死率將高達(dá)30%～40%,其中80%死于病程后期[1]。目前尚缺乏有效的治療藥物和治療措施，糖皮質(zhì)激素用于ALI的治療由來已久,但由于其副作用的原因影響了其使用。本研究將于腹腔注射和局部氣管給藥兩種方式下比較大鼠肺組織TNF-α和IL-10的表達(dá)水平，探討糖皮質(zhì)激素經(jīng)不同給藥途徑對ALI的保護(hù)作用，以期達(dá)到減少糖皮質(zhì)激素用藥劑量、降低副作用并提高療效的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性SD大鼠48只，體重224～271g(由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供)。

1.1.2 主要試劑 LPS( L2880美國sigma公司)，血清TNF-α、IL-10 ELISA測定試劑盒(山東晶美生物科技有限公司)，10%水合氯醛。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理 將雄性SD大鼠隨機(jī)分為6組，每組8只:①正常SD大鼠組；②ALI大鼠組；③ALI大鼠氣管滴注生理鹽水組；④ALI大鼠氣管滴注地塞米松組；⑤ALI大鼠腹腔注射生理鹽水組；⑥ALI大鼠腹腔注射地塞米松組。第①組至第⑥組均稱重記錄體重, ①組直接用10%水合氯醛麻醉處死；②組尾靜脈注射LPS(5 mg/kg)4 h后用10%水合氯醛麻醉處死；③④組麻醉后固定行氣管插管，插管成功后尾靜脈注射LPS(5 mg/kg)，穩(wěn)定15 min后③組經(jīng)氣管滴入生理鹽水(4 mL/kg)，④組氣管滴入地塞米松(10 mg/kg), 4h后處死；⑤⑥組尾靜脈注射LPS(5mg/kg)，15 min后⑤組經(jīng)腹腔注射生理鹽水(4 mL/kg)，⑥組經(jīng)腹腔注射地塞米松(10 mg/kg),4h后用10%水合氯醛麻醉處死；氣管插管的老鼠, 中途間斷注射10%的水合氯醛維持麻醉狀態(tài)。所有大鼠處死后開胸取出肺組織，左肺下葉測濕干比,右肺下葉制作切片檢測模型效果并作病理學(xué)觀察，心尖采血離心血清用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測肺組織TNF-α和IL-10。

1.2.2 肺濕/干重(W/D)比測定 左肺下葉稱重(濕重)后置于70℃烤箱至測量值恒定(即為干重)，然后計算肺W/D值。

1.2.3 組織學(xué)檢查 取右肺下葉肺組織用10%甲醛固定24h,石蠟包埋切片,HE 染色,在普通光學(xué)顯微鏡下觀察,按照Mikawa、Nishina等[2]推薦的方法從以下四個方面進(jìn)行肺損傷程度的評分：①肺泡充血；②出血；③間隙或血管壁可見中性粒細(xì)胞浸潤或聚集；④肺泡間隔增厚或透明膜形成。每項(xiàng)指標(biāo)病變輕重進(jìn)行0～4分半定量分析(0=無損傷，1=輕度損傷，2=中度損傷，3=重度損傷，4=極重度損傷)，累加各項(xiàng)總分作為ALI的病理評分, 判定肺損傷程度。

1.2.4 對所有大鼠進(jìn)行心尖采血，分離心血清按照按試劑盒說明書用ELISA法測定各組SD大鼠血清TNF-α和IL-10的濃度。

2 結(jié)果

各實(shí)驗(yàn)組大鼠在尾靜脈注射LPS后,均出現(xiàn)呼吸急促,口唇發(fā)紺,而地塞米松處理組表現(xiàn)相對較輕,其中氣管給藥組作用尤為明顯，表明ALI造模成功。在實(shí)驗(yàn)所設(shè)定時間點(diǎn)內(nèi)所有大鼠均存活。

2.1 病理學(xué)觀察結(jié)果

2.1.1 肉眼觀察結(jié)果 正常對照組肺表面呈白色略紅,組織柔軟有彈性;ALI模型組可見肺表面呈暗紅色,有明顯充血,包膜緊張,表面分布有瘀斑及點(diǎn)狀的出血灶; 而給藥干預(yù)組大體觀察均有不同程度減輕且氣管給藥組減輕程度相對較明顯(見圖1)。

2.1.2 光鏡結(jié)果 對照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰,肺泡壁薄,肺間質(zhì)無炎性細(xì)胞浸潤,肺泡內(nèi)未見滲液和紅細(xì)胞;模型組肺損傷最明顯,可見肺泡萎陷、肺泡水腫液，肺間質(zhì)明顯增寬、滲出，紅細(xì)胞滲出,以及透明膜形成及炎性細(xì)胞浸潤；給藥干預(yù)組肺泡萎陷、肺泡水腫液,肺間質(zhì)增寬、紅細(xì)胞滲出均有不同程度減輕,其中以氣管給藥干預(yù)組效果較明顯(見圖2)。

注：A:正常對照組；B:ALI組；C:ALI氣管滴生理鹽水組；D:ALI氣管給藥組；E:ALI腹腔注生理鹽水組；F:ALI腹腔給藥組。 圖1 各組大鼠肺臟外觀 圖2 各組大鼠肺組織HE染色結(jié)果(HE×40)

2.1.3 大鼠肺組織損傷評分 相對于正常對照組，各組大鼠肺組織均有不同程度損傷(P<0.05)，而相對于模型對照組,腹腔給藥和氣管給藥組大鼠的肺損傷程度均有緩解(P<0.05)，就兩個給藥組而言，氣管給藥組大鼠的肺損傷程度低于腹腔給藥組(見表1)。

組別損傷評分①正常對照組0.75±0.71 ②ALI組13.63±0.82# ③ALI氣管滴生理鹽水組12.75±1.20# ④ALI氣管給藥組6.38±0.92#◆⑤ALI腹腔注生理鹽水組13.63±1.10# ⑥ALI腹腔給藥組8.75±0.97 #◆▲

注：#vs.①組P<0.05;◆vs.②組P<0.05;▲vs.④組P<0.05。

2.2 肺濕/干重比測定 給大鼠注射LPS,制成ALI模型后，大鼠的肺組織均有明顯的增重(P<0.05)，給以地塞米松干預(yù)后，④組、⑥組大鼠肺組織相比模型組有明顯減輕(P<0.01)，且④組大鼠肺組織的減輕程度比⑥組明顯(P<0.05，見表2)。

組別濕/干重(W/D)①正常對照組4.26±0.11 ②ALI組5.99±0.73#③ALI氣管滴生理鹽水組5.76±0.69#④ALI氣管給藥組4.81±0.17#*⑤ALI腹腔注生理鹽水組5.84±0.65# ⑥ALI腹腔給藥組5.42±0.28#*▲

注：#vs.①組P<0.05;*vs.②組P<0.01;▲vs.④組P<0.05。

2.3 血清TNF-α和IL-10的表達(dá)水平 在給大鼠注射LPS后，TNF-α和IL-10的表達(dá)水平均較對照組大幅提高(P<0.05)，④組和⑥組大鼠給予地塞米松干預(yù)后TNF-α表達(dá)水平均較對照組有所下降(P<0.01)，氣管給藥組下降水平明顯于腹腔給藥組(P<0.05)；④組和⑥組大鼠給予地塞米松干預(yù)后IL-10表達(dá)水平均較對照組有明顯提高(P<0.01)，氣管給藥組作用較腹腔給藥組明顯(P<0.05,見表3)。

組別 TNF-αIL-10①正常對照組15.76±3.8620.01±6.48 ②ALI組106.93±25.07#49.11±12.69# ③ALI氣管滴生理鹽水組103.50±29.76# 49.10±7.71# ④ALI氣管給藥組40.44±12.38#*101.56±6.89#*⑤ALI腹腔注生理鹽水組100.27±20.64#48.99±5.40# ⑥ALI腹腔給藥組59.60±6.31#*▲88.10±6.49#*▲

注：#vs.①組P<0.05;*vs.②組P<0.01;▲vs.④組P<0.05。

3 討論

LPS或膿毒血癥造成肺泡毛細(xì)血管損傷,引起肺水腫,由纖維蛋白,血小板及白細(xì)胞聚集可引起微血栓形成,肺動脈壓的上升,聚集的血小板釋放血管活性物質(zhì),補(bǔ)體激活多形核白細(xì)胞(PMN)而產(chǎn)生聚集[3]。研究表明，促炎和抗炎因子在ALI的發(fā)展過程中起重要作用，促炎因子過度表達(dá)，抗炎因子表達(dá)不足最終將導(dǎo)致炎癥的失控[4-5]。在ALI的發(fā)生發(fā)展中TNF-α具有觸發(fā)進(jìn)一步炎癥反應(yīng)的作用,所以被稱之為“早期反應(yīng)細(xì)胞因子”[6],可直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，激活PMN和凝血系統(tǒng)、損害肺泡表面活性物質(zhì)等從而造成ALI[7]。IL-10為機(jī)體重要的抗炎因子，可以抑制單核巨噬細(xì)胞的作用，抑制TNF-α、IL-1β、PAF、IFN-1 和PLA2促炎因子的產(chǎn)生，緩解炎癥，減輕損傷[8]。

當(dāng)發(fā)生ALI時，機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下, 腎上腺皮質(zhì)可的松分泌水平將升高,此時已經(jīng)存在相對性的腎上腺皮質(zhì)功能不全, 外源性投用糖皮質(zhì)激素對于危重患者僅相當(dāng)于給以替代劑量以緩解或糾正腎上腺皮質(zhì)功能不全,理論上給予適量激素治療是可行的，糖皮質(zhì)激素也可直接、間接作用于與炎癥反應(yīng)有關(guān)的炎性細(xì)胞及細(xì)胞因子等[9]。臨床使用糖皮質(zhì)激素冶療ALI多是通過靜滴或注射，這種全身給藥方式用藥量大，副作用明顯。本研究通過比較地塞米松在不同給藥途徑下對ALI大鼠的療效，發(fā)現(xiàn) ALI模型組及各處理組的肺組織W/D比值均明顯較正常SD大鼠組高，光鏡檢查結(jié)果也顯示肺間質(zhì)明顯增寬、滲出、水腫、 出血、透明膜形成及炎性細(xì)胞浸潤,與此同時,TNF-α及IL-10均較對照組明顯升高,說明ALI模型組及各處理組均有不同程度的炎癥發(fā)生，在炎癥發(fā)生的應(yīng)激條件下，促炎因子和抑炎因子均升高,由于肺組織細(xì)胞水腫而導(dǎo)致W/D比值升高。相對于ALI模型組，無論是腹腔給藥組還是氣管給藥組TNF-α濃度、W/D比值均降低，IL-10濃度均升高，說明兩種給藥方式都有一定的緩解炎癥的作用。在促炎因子濃度降低和抑炎因子增加的雙重作用下炎癥減輕，水腫程度得到緩解，W/D比值降低，但未能恢復(fù)到正常水平。相對于腹腔注射地塞米松組，氣管滴注地塞米松組的TNF-α濃度、肺組織W/D比值總體降低，而IL-l0濃度總體較高，說明氣管給以地塞米松在用藥量降低的前提下緩解炎癥的作用強(qiáng)于腹腔給藥。相應(yīng)結(jié)果在光鏡下也得到證實(shí)，表明使用地塞米松氣管滴注，在降低用藥劑量的條件下，仍然具有較好的療效，提示在臨床上通過局部應(yīng)用糖皮質(zhì)激素即可避免大劑量用藥引起的副反應(yīng)，還可達(dá)到較好的治療效果。

綜上所述，應(yīng)用糖皮質(zhì)激素氣管給藥治療LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI，可增加大鼠TNF-α和IL-10的表達(dá)，減輕病理損害，提示通過這種給藥方式降低副作用和提高療效可能是糖皮質(zhì)激素臨床用藥可以嘗試的途徑之一。

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