馬 赫，李若凡，張 釗，姚天明

1.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員旅，陜西 西安 710032；2.沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016

鋅是人體內(nèi)代謝必需的微量元素之一，在促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育、調(diào)節(jié)機(jī)體代謝及維持人體正常生理功能中發(fā)揮著重要的作用[1]。縫隙連接是細(xì)胞間信號(hào)傳遞的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，在心臟電傳導(dǎo)活動(dòng)中發(fā)揮著重要的作用[2]。心肌同步收縮的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)閏盤中大量分布縫隙連接蛋白(connexin Cx)，其中心室肌縫隙連接蛋白主要由Cx43構(gòu)成[3]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，心律失?；颊哐邃\水平顯著降低，且隨著病程的延長(zhǎng)，降低水平逐漸顯著[4]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證明，硫酸鋅可以減少缺血再灌注后心肌細(xì)胞損傷，起到保護(hù)心肌的作用[5,6]。然而硫酸鋅預(yù)處理對(duì)再灌注心律失常發(fā)生的影響及機(jī)制仍存在爭(zhēng)議。有研究顯示，縫隙連接的結(jié)構(gòu)和功能變化會(huì)引起電脫偶聯(lián)，也是室性心律失常發(fā)生的重要因素，縫隙連接通道的關(guān)閉是電沖動(dòng)傳導(dǎo)緩慢及異常傳導(dǎo)的基礎(chǔ)[7-9]。已有研究顯示，缺血早期縫隙連接的關(guān)閉過(guò)程中有Cx43的去磷酸化發(fā)生[10,11]。本文通過(guò)建立大鼠心肌缺血再灌注模型，探討硫酸鋅預(yù)處理對(duì)大鼠再灌注心律失常發(fā)生和Cx43磷酸化水平的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 小鼠抗大鼠總Cx43(T-Cx43)一抗、兔抗大鼠磷酸化Cx43(p-Cx43)一抗均購(gòu)自美國(guó)ABcam公司；小鼠抗Tubulin單克隆抗體、HRP羊抗小鼠二抗、HRP羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 動(dòng)物分組及建立模型

1.2.1 動(dòng)物分組 雄性成年SD大鼠，體重250～280 g(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。隨機(jī)分為4組，每組6只。(1)假手術(shù)+生理鹽水預(yù)處理組(Sham+Sa組):前股靜脈注射等量生理鹽水，開胸后只穿線不結(jié)扎血管，麻醉維持90 min；(2)假手術(shù)+硫酸鋅預(yù)處理組(Sham+Zn組)：開胸缺血前10 min經(jīng)股靜脈注射硫酸鋅溶液8 mg/kg，余同Sham+Sa組；(3)缺血再灌注+生理鹽水預(yù)處理組(I/R+Sa組)：開胸前股靜脈注入等量的生理鹽水，缺血30 min，再灌注60 min；(4)缺血再灌注+硫酸鋅預(yù)處理組(I/R+Zn組)：開胸前股靜脈注入硫酸鋅溶液8 mg/kg，缺血30 min，再灌注60 min。

1.2.2 建立模型 SD大鼠以戊巴比妥鈉麻醉后，取仰臥位固定，用針形電極插入其四肢皮下，連續(xù)監(jiān)測(cè)Ⅱ?qū)?lián)心電圖變化。對(duì)大鼠行氣管插管，連接微型動(dòng)物呼吸機(jī)后，于胸骨左緣3～4肋間開胸，逐層分離暴露心臟，分離心包，于冠狀動(dòng)脈左前降支距左心耳下緣2 mm處穿針，兩線頭共同穿過(guò)一直徑為3 mm的乳膠管，輕提絲線并推下套管動(dòng)脈夾夾閉造成心肌缺血，松開動(dòng)脈夾形成再灌注。心電圖ST段抬高，結(jié)扎線以下部位心肌顏色變暗為心肌缺血標(biāo)志，再灌注后ST段回落，心肌缺血區(qū)由暗紅色轉(zhuǎn)為紅色，表示再灌注成功。

1.3 心電圖觀察指標(biāo)及評(píng)分方法 觀察心電圖Ⅱ?qū)?lián)再灌注60 min內(nèi)心電圖ST段及QRS波變化，以改良的Curtis 和 Ravingerova評(píng)分方法評(píng)分。1分：ST段抬高或QRS波增寬；2分：偶發(fā)室性早搏(VE)；3分：成對(duì)VE、VE二聯(lián)律三聯(lián)律或VE≥5次；4分：頻發(fā)VE(1min內(nèi)≥5次)；5分：<30 s室性心動(dòng)過(guò)速(VT)；6分：≥30 s室性心動(dòng)過(guò)速；7分：心室顫動(dòng)(VF)多次累計(jì)>30 s；8分：VF連續(xù)<5 min；9分：VF多次累計(jì)<5 min或一次≥5 min；10分：VF多次累計(jì)>5 min。

1.4 心肌標(biāo)本的取材及凍存 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，即刻取動(dòng)物心臟，取結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支以下的整層心肌，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗凈表面血液后濾紙吸干后放入液氮中凍存，隨后取出放入-80 ℃冰箱保存。

1.5 Werstern-Blot檢測(cè) 將凍存的心肌組織塊研磨勻漿后，用裂解液提取組織蛋白，進(jìn)行蛋白定量，12%分離膠和5%濃縮膠上樣電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，3%牛血清白蛋白(BSA)封閉1 h，分別加入小鼠抗T-Cx43蛋白單克隆一抗、小鼠抗p-Cx43蛋白一抗和小鼠抗Tubulin一抗4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜6次，每次5 min。室溫下孵育相應(yīng)二抗1.5 h，同前洗膜，顯影液發(fā)光分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 4組大鼠心電圖檢測(cè)結(jié)果 I/R+Sa組有4只發(fā)生VT，其中1只VT<30 s，1只VT一陣≥30 s，2只VF多陣?yán)塾?jì)>30 s；5只發(fā)生VE，其中3只為頻發(fā)，2只為偶發(fā)，6只均有明顯的ST段抬高及QRS波增寬。Sham+Sa組及Sham+Zn組無(wú)VT發(fā)生，各有3只出現(xiàn)ST段抬高或QRS波增寬，Sham+Sa組有1只出現(xiàn)偶發(fā)VE；I/R+Zn組有3只出現(xiàn)VT，均為<30 s，1只出現(xiàn)頻發(fā)VE，2只出現(xiàn)偶發(fā)VE，程度均較I/R+Sa組減輕，5只出現(xiàn)ST段抬高或QRS波增寬。以改良Curtis 和Ravingerova評(píng)分方法評(píng)分，Sham+Sa組為(0.833±0.307)分，Sham+Zn組為(0.500±0.224)分，I/R+Sa組為(7.833±0.946)分，I/R+Zn組為(4.667±0.558)分。

2.2 Western-Blot檢測(cè)結(jié)果 4組T-Cx43、p-Cx43及Np-Cx43均有表達(dá)。與Sham+Sa組及Sham+Zn組相比，I/R+Sa組T-Cx43及p-Cx43蛋白表達(dá)水平降低(P<0.01)，I/R+Zn組T-Cx43及p-Cx43蛋白表達(dá)水平升高(P<0.01)，與Sham+Sa組及Sham+Zn組相近(P<0.01)。見(jiàn)圖1，圖2。

注：p-Cx43：磷酸化Cx43蛋白；Np-Cx43：非磷酸化Cx43蛋白；Tubulin：內(nèi)參蛋白。圖1 各組Cx43表達(dá)和磷酸化檢測(cè)結(jié)果

注：T-Cx43：總Cx43；p-Cx4：磷酸化Cx43。與Sham+Sa組比較，a P<0.01; 與I/R+Sa組比較，b P<0.01。圖2 各組Cx43表達(dá)和磷酸化情況

3 討 論

鋅是體內(nèi)代謝必需的微量元素之一，在促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育、增強(qiáng)人體免疫力、調(diào)節(jié)各種酶的活性及受體等方面發(fā)揮重要的作用[12]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，冠心病、心肌梗死等患者體內(nèi)的微量元素鋅水平顯著降低[13-15]。有研究表明，鋅可對(duì)壞死的心肌起到保護(hù)作用，其作用與硝酸甘油及普萘洛爾相似，但作用較弱[5]。在多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，鋅對(duì)實(shí)驗(yàn)性心律失常的作用得到肯定。然而鋅預(yù)處理對(duì)缺血再灌注心律失常的作用仍然存在爭(zhēng)議，而其抗心律失常作用是否與調(diào)節(jié)Cx43有關(guān)仍未得到證實(shí)。

Cx43與心律失常的發(fā)生關(guān)系密切，尤其是致命性室性心動(dòng)過(guò)速及室顫，均與心室肌中Cx43的重構(gòu)有關(guān)[16,17]。Gutstein等[18]研究證實(shí)，敲除心臟Cx43基因的大鼠，心室傳導(dǎo)速率明顯減慢，并有引起心源性猝死的可能。Kieval等[19]研究也發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注心肌中Cx43的表達(dá)減少，其分布也發(fā)生改變，生理狀態(tài)下其主要在閏盤呈現(xiàn)簇狀分布于端端連接處，而心肌梗死后，其主要分布于側(cè)側(cè)連接處。以上研究均表明，Cx43的表達(dá)和分布變化可以影響心室肌的電傳導(dǎo)活動(dòng)，并在室性心律失常的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。

本實(shí)驗(yàn)主要研究硫酸鋅預(yù)處理對(duì)大鼠缺血再灌注后心律失常發(fā)生的影響及其對(duì)Cx43表達(dá)的影響。在成功建立大鼠缺血再灌注模型后，通過(guò)硫酸鋅預(yù)處理，觀察大鼠再灌注后心律失常發(fā)生情況。研究發(fā)現(xiàn)，硫酸鋅預(yù)處理可以顯著降低大鼠再灌注心律失常發(fā)生的程度，可以在一定程度上防止惡性心律失常的發(fā)生，降低死亡風(fēng)險(xiǎn)。為進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)對(duì)Cx43的表達(dá)及磷酸化水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注后Cx43的表達(dá)水平及磷酸化水平均有明顯降低；給予硫酸鋅預(yù)處理后，其表達(dá)和磷酸化水平升高并與Sham+Sa組及Sham+Zn組相近。磷酸化是蛋白轉(zhuǎn)錄后的一種常見(jiàn)的修飾方式，連接蛋白中大部分都需經(jīng)磷酸化修飾后表現(xiàn)活性。機(jī)體通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白激酶和蛋白磷酸化酶的相互作用，控制許多細(xì)胞內(nèi)過(guò)程，包括連接蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)、組裝、解離等[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，生理狀況下Cx43主要以磷酸化水平存在，在缺血再灌注損傷后，心室肌Cx43的表達(dá)量下降，磷酸化Cx43含量也顯著降低，表達(dá)含量的降低和磷酸化水平的降低導(dǎo)致心肌組織的阻抗增加、電導(dǎo)性下降，出現(xiàn)縫隙連接的電脫耦連現(xiàn)象，導(dǎo)致折返性電活動(dòng)的發(fā)生，最終引起嚴(yán)重的室性心律失常[21]。硫酸鋅預(yù)處理后，Cx43的表達(dá)及磷酸化水平均有提高。Cx43的表達(dá)和磷酸化檢測(cè)結(jié)果與心律失常評(píng)分結(jié)果一致，也進(jìn)一步證明了Cx43在缺血再灌注心律失常中的作用，以及硫酸鋅可以通過(guò)影響Cx43的表達(dá)減低缺血再灌注心律失常發(fā)生的頻率及程度。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，缺血再灌注后大鼠的心律失常發(fā)生率明顯上升，而硫酸鋅預(yù)處理可以顯著降低心律失常發(fā)生率及程度，其作用機(jī)制可能與硫酸鋅調(diào)控缺血再灌注后Cx43表達(dá)及磷酸化水平有關(guān)。然而Cx43的分布也可能影響缺血再灌注心律失常的發(fā)生，硫酸鋅是否可能通過(guò)影響其分布改善缺血再灌注心律失常的程度，硫酸鋅如何調(diào)控Cx43的表達(dá)及磷酸化水平仍有待進(jìn)一步探討。

[1] Martínez-Ballesta MC,Dominguez-Perles R,Moreno DA,et al.Minerals in plant food:effect of agricultural practices and role in human health.A review[J].Agro Sust Dev,2010,30(2):295-309.

[2] Gros DB,Jongsma HJ.Connexins in mammalian heart function[J].Bioessays,1996,18(9):719-730.

[3] van Kempen MJ,ten Velde I,Wessels A,et al.Differential connexin distribution accommodates cardiac function in different species[J].Microsc Res Tech,1995,31(5):420-436.

[4] 徐光來(lái),馮亞琴.心律失常與血清硒、錳、鋅、銅、鐵變化的關(guān)系[J].臨床心血管病雜志,1994,10(4):224-226.

[5] 李金恒,丁國(guó)華.硫酸鋅抗實(shí)驗(yàn)性心肌缺血和心律失常的作用[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),1993,9(2):152.

[6] Powell S,Saltman P,Uretzky G,et al.The effect of zinc on reperfusion arrhythmias in the isolated perfused rat heart[J].Free Radic Biol Med,1990,8(1):33-46.

[7] Jongsma HJ,Wilders R.Gap junctions in cardiovascular disease[J].Circu Res,2000,86(12):1193-1197.

[8] Dhein S.Gap junction channels in the cardiovascular system:pharmacological and physiological modulation[J].Trends Pharm Sci,1998,19(6):229-241.

[9] Severs NJ.Pathophysiology of gap junctions in heart disease[J].J Cardiovasc Electr,1994,5(5):462-475.

[10]Jeyaraman MM,Srisakuldee W,Nickel BE,et al.Connexin43 phosphorylation and cytoprotection in the heart[J].Biochim Biophys Acta,2012,1818(8):2009-2013.

[11] Beardslee MA,Lerner DL,Tadros PN,et al.Dephosporylation and intracellular redistribution of ventricular connexin 43 during electrical uncoupling induced by ischemia[J].Circ Res,2000,87:656-662.

[12] Wood RJ.Assessment of marginal zinc status in humans[J].J Nutr,2000,130(5):1350S-1354S.

[13] Kazi TG,Afridi HI,Kazi N,et al.Distribution of zinc,copper and iron in biological samples of Pakistani myocardial infarction (1st,2nd and 3rd heart attack) patients and controls[J].Clin Chim Acta,2008,389(1):114-119.

[14] Tang YR,Zhang SQ,Xiong Y,et al.Studies of five microelement contents in human serum,hair,and fingernails correlated with aged hypertension and coronary heart disease[J].Biol Trace Element Res,2003,92(2):97-103.

[15] 孟曉萍,高山.冠心病及心律失?；颊哐邈~鋅含量的測(cè)定與分析[J].佳木斯醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1992,15(6):37-38.

[16] Ruiz-Meana M,Rodríguez-Sinovas A,Cabestrero A,et al.Mitochondrial connexin43 as a new player in the pathophysiology of myocardial ischaemia-reperfusion injury[J].Cardiovas Res,2008,77(2):325-333.

[17] 王偉光,張權(quán)宇,曹鈺琨,等.κ阿片受體可以通過(guò)抑制β腎上腺素受體進(jìn)而調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞Cx43發(fā)揮抗缺血再灌注性心律失常[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2010,26(4):471-476.

[18] Gutstein DE,Morley GE,Tamaddou H,et al.Conduction slowing and sudden arrhythmic death in mice with cardiac-restricted inactivation of connexin 43[J].Circ Res,2001,88(3):333-339.

[19] Kieval RS,Spear JF,Moore EN,et al.Gap junctional conductance in ventricular myocyte pairs isolated from postischemic rabbit myocardium[J].Circ Res,1992,11:127-136.

[20] Lampe PD,Lau AF.The effects of connexin phosphorylation on gap junctional communication[J].Int J Biochem Cell Biol,2004,36:1114-1116.

[21] De Groot JR,Coronel R.Acute ischemia-induced gap junctional uncoupling and arrhythmogenesis[J].Cardiovas Res,2004,62(2):323-334.