宋振全，趙 旭，，劉恩智，柳云恩，張 興，張海松，單提坤，趙 航

1.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院神經外科，遼寧 沈陽 110016；2.遼寧醫(yī)學院研究生學院，遼寧 錦州 121001；3.沈陽軍區(qū)重癥(戰(zhàn))創(chuàng)傷實驗室，遼寧 沈陽 110016

腦水腫是創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)后的基本病理過程之一，也是致殘、致死的重要因素之一[1]。研究發(fā)現，水孔通道蛋白4(aquaporin4，AQP4)與腦水腫的發(fā)生發(fā)展有著緊密的聯系[2,3]。將序列特異性雙鏈RNA (dsRNA)導入機體，使細胞內同源mRNA降解，產生特異的基因沉默，這種現象被稱為RNA干擾(RNA interference，RNAi)。有研究利用RNA干擾技術，設計合成靶向AQP4的RNA片段，通過有效的細胞轉染，對AQP4進行基因表達沉默，可以有效地抑制腦水腫的發(fā)生發(fā)展[4]。臨床研究認為，創(chuàng)傷性腦水腫的早期治療最為關鍵，但損傷早期的機制十分復雜，有必要找出一種快速有效地抑制AQP4蛋白的方法，以便于研究腦水腫初期損傷的機制和指導臨床用藥。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物分組 健康成年雄性Wistar大鼠18只，體重250～300 g。由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院動物實驗中心提供[實驗中心許可證號SYXK(軍)2002-019][動物許可證號SCXK(軍)2002-0174]，大鼠自由獲得食物及水，在14 h/10 h的照明/熄燈周期條件下喂養(yǎng)。實驗動物按隨機數字表法分為注射陰性對照液組、注射725鏈組和注射1006鏈組。

1.1.2 主要試劑及儀器 根據分析軟件設計并篩選出2條大鼠AQP4siRNA鏈，分別為：大鼠小干擾RNA(Aqp4-rat-725：5′GCAGUUAUCAUGGGAAACUTT 3′，5′AGUUUCCCAUGAUAACUGCTT 3′)；(Aqp4-rat-1006：5′CUCGUCUGGAGAGGUAUUATT 3′，5′UAAUACCUCUCCAGACGAGTT 3′)(上海吉瑪公司設計并制備)。AQP4siRNA濃度為10 μmol/L，是將0.25 OD siRNA溶于20 μL 焦磷酸二乙酯(DEPC)水中配得。兔抗鼠AQP4抗體(BA1560， 武漢博士德公司)；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG (St.Louis，MO，北京中杉公司)；AQP4原位雜交檢測試劑盒(武漢博士德公司)。

主要儀器有：Olympus熒光顯微鏡IX71(日本東京)；SR-6R大鼠腦立體定向儀(日本東京三菱公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 立體定向腦室內給藥 采用水合氯醛350 mg/kg腹腔內注射麻醉，俯臥位固定，頭部備皮、消毒。于前囟后約1.0 mm，以中線旁開1.5 mm為中心，以磨鉆磨一骨窗，直徑約2 mm，顯露硬腦膜。以微量注射器自骨窗中心腦表面垂直進針3.5 mm，向腦室內緩慢注射(約5 min)AQP4siRNA或陰性對照液20 μL，等待3～5 min后緩慢退針(約2 min)。

1.2.2 各實驗組處理 3月齡雄性Wistar大鼠，按照隨機數字表法將其分為：注射陰性對照液組、注射725鏈組和注射1006鏈組。各組分別經過腦室注射陰性對照液、725鏈siRNA或1006鏈siRNA。

1.2.3 一般情況觀察 大鼠蘇醒后觀察精神、飲食、運動及肢體運動改變情況。

1.2.4 灌注、取材及包埋 大鼠麻醉后，顯露心臟，左心室插管后剪開右心耳，快速灌注4%多聚甲醛200 mL，直至流出液體清亮；灌注完畢后取全腦，冠狀切取損傷中心腦組織， 置于4%多聚甲醛中浸泡固定4 h；經梯度酒精脫水，二甲苯透明，進行石蠟包埋。

1.2.5 AQP4蛋白免疫組織化學觀察 石蠟切片預處理后滴加1∶200免抗鼠AQP4多克隆抗體，陰性對照組標本加入等量抗體稀釋液，37 ℃孵育2 h；滴加1∶100/磷酸鹽緩沖液(PBS)生物素化抗體，37 ℃孵育30 min；滴加1∶100/PBS 鏈霉親和素-生物素復合物(SABC)，37 ℃孵育30 min。通過圖像分析軟件計算全腦單位面積的AQP4免疫陽性強度。

1.2.6 原位雜交方法檢測AQP4 mRNA的表達 石蠟切片經預處理后，通過AQP4原位雜交試劑盒鑒定AQP4mRNA的表達，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，顯微鏡下觀察，并通過圖像分析軟件計算全腦單位面積AQP4mRNA平均陽性強度。

2 結 果

2.1 免疫組織化學結果 注射725鏈組和注射1006鏈組AQP4蛋白含量較注射陰性對照液組明顯減少，兩條siRNA鏈均能有效減少AQP4蛋白的含量( 圖1，表1)。與注射1006鏈組比較發(fā)現，注射725鏈組對AQP4蛋白含量的抑制效果更加顯著。AQP4陽性染色位于星形膠質細胞、室管膜細胞和血管間隙，神經元為陰性。注射725鏈組和注射1006鏈組在全腦單位面積的AQP4免疫陽性強度顯著低于注射陰性對照液組。其中，注射725鏈組單位面積AQP4免疫陽性強度顯著低于注射1006鏈組。

表1 各組大鼠腦內AQP4蛋白平均陽性細胞面積

注：與注射陰性對照液組比較，aP<0.05，與注射725鏈組比較，bP<0.05。

2.2 原位雜交結果 注射725鏈組和注射1006鏈組AQP4mRNA含量較注射陰性對照液組明顯減少，兩條siRNA鏈均能有效減少腦組織中AQP4mRNA的含量(圖2，表2)。與注射1006鏈組比較發(fā)現，注射725鏈組對AQP4mRNA含量的抑制效果更加顯著。AQP4mRNA原位雜交陽性細胞為棕褐色染色，陽性染色位于神經元和星形膠質細胞胞漿。注射725鏈組和注射1006鏈組在全腦單位面積的AQP4mRNA陽性強度顯著低于注射陰性對照液組。其中，注射725鏈組AQP4mRNA平均陽性強度顯著低于注射1006鏈組。

注： A：注射陰性對照液組；B：注射725鏈組；C：注射1006鏈組。圖2 各組大鼠腦內的AQP4mRNA原位雜交染色

表2 各組大鼠腦內AQP4mRNA平均陽性細胞面積

注：與注射陰性對照液組比較，aP<0.05；與注射725鏈組比較，bP<0.05。

3 討 論

AQP4蛋白主要存在于中樞神經系統的室管膜上皮細胞、蛛網膜下腔的軟腦膜細胞和血管周圍的星形細胞等[5,6]，是膠質細胞、腦脊液以及血管之間相互調節(jié)和運輸水分的重要結構基礎[7]。研究證實，AQP4可以易化大腦中細胞內外水分的快速交換，在病理條件下可以導致水分的積累[8,9]。

目前，按照干擾RNA合成方法的不同分為5種，即化學合成法、體外轉錄法、“雞尾酒”法、質?；虿《据d體介導的siRNA體內表達和siRNA表達框介導的siRNA體內表達。本實驗證實，化學合成法合成的siRNA具有合成方便、起效快和沉默時間較短的特點。而使用病毒或質粒介導的siRNA體內表達無法在數小時內有效沉默目的蛋白。創(chuàng)傷性腦水腫早期損傷的機制十分復雜，治療很關鍵，而化學合成法合成的725鏈siRNA對于AQP4蛋白沉默具有起效快、效率高、時間短的特點，便于研究腦損傷早期治療時機的選擇。

綜上所述，腦室給予化學合成的siRNA725鏈，可以在短期(6 h)內顯著降低腦組織中AQP4的mRNA和蛋白質水平，這將更適于腦損傷早期機制的研究，從而進一步指導臨床用藥。

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