王淑菁，付 瑞，李曉波，王 吉，衛(wèi) 禮，鞏 薇，賀爭鳴，岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所；國家實驗動物質(zhì)量檢測中心，北京 100050)

樹鼩(tree shrew,Tupaiabelangeri)，屬于攀鼩目樹鼩科，主要生活在熱帶和亞熱帶森林、灌叢、村落附近，在東南亞和我國云南、廣西、海南、貴州等地有較多分布。樹鼩被認為是靈長類最親密的近親，已有報道表明樹鼩非常適合用于研究人體的近視、心理應激和肝炎等問題[1]。因此，樹鼩作為一種新型實驗動物資源越來越受重視。目前研究中使用的樹鼩大多來自野外或馴化后代，實驗動物的質(zhì)量難以保證，其自然攜帶病毒尚不清楚。將野生樹鼩進行人工馴化、飼養(yǎng)、繁殖與規(guī)范化管理，對其攜帶的病毒、細菌、寄生蟲指標進行控制，建立標準化的樹鼩種群勢在必行[2,3]。

腺病毒(adenovirus, ADV)屬于腺病毒科。迄今為止已發(fā)現(xiàn)至少100多種腺病毒可感染人、哺乳動物和禽類。腺病毒可引起多種急性上呼吸道感染、急性眼結膜炎、急性出血性膀胱炎、腹瀉等[4]。80年代以來，國內(nèi)外學者從野生樹鼩的咽拭子、腎組織培養(yǎng)物和糞便中分離出樹鼩腺病毒。目前尚未建立相應的樹鼩腺病毒血清學和分子生物學檢測方法。因此，本研究將建立樹鼩腺病毒(TAV)PCR檢測方法，并進行初步應用。

1 材料和方法

1.1 陽性標準質(zhì)粒和毒種

由于目前無樹鼩腺病毒標準毒種及分離株，將構建陽性標準質(zhì)粒作為陽性對照。查詢NCBI上樹鼩腺病毒(TAV)序列，選擇樹鼩腺病毒基因組保守特異區(qū)域(19418-19917區(qū)域)，委托Takara公司合成約500bp目的片段，插入pMD18-T載體，構建陽性標準質(zhì)粒。禽腺病毒I型(CELO VR-432株)購買于ATCC，禽腺病毒III型(EDS AV127株)購于中國獸藥監(jiān)察所。猴腺病毒-1和猴腺病毒-20均為本科室保存。

1.2 引物設計

使用primer 5軟件在TAV 19418-19917區(qū)域設計引物。上游引物:GCGGAGCGGGTTGTA GGGTA；下游引物:TCGTGCGGCTGGCGTTTT。委托Takara公司合成。

1.3 樣本采集及DNA提取

樣本均為云南來源樹鼩。無菌采集60份樹鼩EDTA抗凝血，使用Qiagen的 Dneasy Blood & Tissue Kit 試劑盒(Cat.No69504)提取血DNA。采集56份樹鼩糞便，使用Qiagen的DNA Stool Mini Kit的試劑盒(Cat.No51504)提取糞便DNA。詳細操作根據(jù)產(chǎn)品說明書。

1.4 PCR擴增體系

PCR反應體系為25 μL，包括：10 x PCR buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，ddH2O 17.35 μL，引物各1 μL，DNA 1 μL，HS Taq酶0.15 μL。PCR反應條件為：94℃ 預變性5 min；94℃ 1 min，退火溫度 1 min，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳測定。PCR產(chǎn)物送Takara公司進行序列測定。

1.5 特異性測定

將擴增得到的目的片段測序，與NCBI序列比對確定是否為特異性片段。提取禽腺病毒I型、禽腺III型、猴腺病毒-1，猴腺病毒-20，考察該方法的特異性。

1.6 靈敏度測定

陽性標準質(zhì)粒的DNA濃度為13.5 μg/mL，將其倍比稀釋從13.5 ×100至13.5 × 10-9μg/mL，以考察該PCR方法的靈敏度。

1.7 初步應用

使用該PCR方法檢測60份樹鼩血DNA及56份樹鼩糞便DNA。

2 結果

2.1 反應體系的建立

TAV經(jīng)特異性擴增得到495 bp目的片段，將擴增得到的目的片段經(jīng)測序后，與NCBI網(wǎng)站上的序列一致率為100%。

2.2 特異性測定

以禽腺病毒I型、禽腺III型、猴腺病毒-1，猴腺病毒-20做對照，結果顯示僅樹鼩腺病毒陽性質(zhì)粒擴增得到495 bp目的片段(圖1)。

2.3 靈敏度測定

倍比稀釋樹鼩腺病毒陽性質(zhì)粒DNA，濃度從13.5 ×100至13.5 × 10-9μg/mL，結果顯示其靈敏度至13.5 ×10-7μg/mL(圖2)。

2.4 初步應用

提取60份樹鼩血DNA，PCR方法檢測樹鼩腺病毒結果均為陰性。提取56份樹鼩糞便DNA，使用該引物擴增，有些DNA樣品在495 bp左右出現(xiàn)兩條疑似條帶(圖3)。由于這兩條帶片段大小十分相近，無法判定哪條是所擴增的目的條帶，即495 bp-A、495 bp-B(圖4)，將兩條帶均切膠純化后測序。測序得到的序列與NCBI網(wǎng)站序列比對，495 bp-A與樹鼩腺病毒序列一致，說明該條帶為目的片段；而495 bp-B與亞希熱菌屬序列一致率為93%，為非特異擴增。此外，將495 bp-A與495 bp-B比對，無任何相似序列。

M：100 bp marker；1：樹鼩腺病毒陽性質(zhì)粒；2：禽腺病毒I型；3：禽腺病毒III型；4：猴腺病毒-1；5：猴腺病毒-20；6：陰性對照

M：100 bp marker； 1：13.5 μg/mL； 2：13.5 ×10-1 μg/ml； 3：13.5 ×10-2 μg/mL； 4：13.5 ×10-3 μg/mL； 5：13.5 ×10-4 μg/mL； 6：13.5 ×10-5 μg/mL； 7：13.5 ×10-6 μg/mL； 8：13.5×10-7 μg/mL； 9：13.5 ×10-8 μg/mL.

M：100 bp marker；TAV：樹鼩腺病毒陽性質(zhì)粒；1-20、22-41、43-58： 56份樹鼩糞便DNA；21、42、59：陰性對照

使用DNAstar軟件將495 bp-A序列與NCBI網(wǎng)站上提供的樹鼩腺病毒、猴腺病毒I型、人腺病毒、禽腺病毒I型及III型序列進行同源性比對，并作出遺傳進化樹(圖5、6)。由圖可知，TAV-495-A與樹鼩腺病毒比對一致率為100%。與禽腺病毒相比，樹鼩腺病毒與同為靈長類的人腺病毒、猴腺病毒I型序列同源性最高。

3 討論

Darai等[5]1980年報道從38份樹鼩腎組織培養(yǎng)物中分離到1株TAV，能凝集大鼠和人“O”型紅細胞。陳元鼎等[6]1987年報道，從90份成年云南樹鼩大便中檢測到12份腺病毒陽性樣本，陽性率為3%。吳小閑等[7]1990年報道，從云南野生樹鼩咽拭子、腎細胞培養(yǎng)物和糞便中分離出10株TAV，并鑒定為2個血清型(TAV-1和TAV-2)。韓建保等[8]使用人源ELISA試劑盒對272份野生俘獲和人工繁殖的中緬樹鼩血清樣本進行腺病毒等六種病毒的檢測，結果腺病毒IgG抗體均為陰性。

M：100 bp marker；1-4：495 bp-A條帶；5：樹鼩腺病毒陽性質(zhì)粒；6-9：495 bp-B條帶

圖5 TAV-495-A與多個種屬腺病毒序列的同源性比較

圖6 TAV-495-A與多個種屬腺病毒間的遺傳進化樹

本研究中由于沒有標準毒株及分離株，人工構建了陽性標準質(zhì)粒作為陽性對照。根據(jù)NCBI網(wǎng)站提供的TAV序列，通過與人腺病毒、猴腺病毒、鼠腺病毒及禽腺病毒的序列比對，選擇其特異區(qū)域(即19418-19917區(qū)域)人工合成一段DNA序列，插入pMD18-T載體，構建了陽性標準質(zhì)粒。

根據(jù)構建的陽性標準質(zhì)粒的序列，設計1對特異性引物，并進行反應體系的優(yōu)化，建立了TAV的PCR檢測方法，結果顯示該方法特異性好，靈敏度可至13.5 x10-7μg/mL。

使用該PCR方法對60份樹鼩血DNA檢測，結果均為陰性。對56份樹鼩糞便DNA檢測，結果顯示有目的條帶擴增，此外發(fā)現(xiàn)有非特異性條帶擴出。由于非特異性條帶與目的條帶的大小相近，對兩個片段均進行測序驗證。結果顯示，測序證實樹鼩糞便中TAV感染率為42.9%，與PCR擴增結果一致。非特異條帶的測序結果與亞希熱菌屬序列一致率為93%，這說明糞便樣本中可能存在這類菌屬感染。實驗中對56份樹鼩糞便進行DNA提取時，未對糞便進行稀釋后除菌過濾，而是將糞便中所含的病毒、細菌DNA均進行提取后實驗。這提示做病毒PCR檢測時，最好將樣本除菌過濾，以降低細菌的非特異性擴增的幾率。

本研究對云南來源樹鼩糞便樣本檢測中，顯示腺病毒的陽性率達42.9%。樹鼩作為近年來最有潛力的實驗動物之一，并進行系統(tǒng)的實驗動物化工作，其病毒感染情況應引起實驗動物科技界的足夠重視。

參考文獻：

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[5] Darai G, Matz B, Flügel RM, et al. An adenovirus from tupaia (tree shrew), growth of the virus, characterization of viral DNA and transforming ability [J]. Virology, 1980, 104-122.

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[8] 韓建保, 張高紅, 段勇, 等. 中緬樹鼩自然感染六種病毒的血清流行病學 [J].動物學研究, 2011, 32(1): 11-16.