陳 琳，樂 凱，茹 琴，田 香，熊 琪，馬寶苗，劉 璐，吳日輝，邢俊俏，王 寧，張 琨，趙小偉，陳 衛(wèi)，何 麗，歐陽康樂，司遠仁，李超英,4,

(1.江漢大學武漢生物醫(yī)學研究院，湖北 武漢 430056； 2. 福格森(武漢)生物科技股份有限公司，湖北 武漢 430050；3. 湖北省中山醫(yī)院，湖北 武漢 430032；4. 漢濟生物科技(武漢)有限公司，漢濟生物醫(yī)藥研究院，湖北 武漢 430075；)

保健食品安全性和功能評價是國家對保健食品安全監(jiān)管的一項重要措施[1]。在輔助降血糖功能試驗評價中，成功構建實驗性高血糖模型是前提，功能試驗周期一般長達4～6周，因此保持該模型的穩(wěn)定性是評價工作順利進行的重要保障。四氧嘧啶(alloxan，ALX)誘導實驗性高血糖模型的方法因其能高度模擬人類糖尿病臨床表現(xiàn)而被國際上一貫用于糖尿病機制研究[2]，同時也是我國保健食品安全性和功能評價試驗中采用的經(jīng)典造模方法[3]。影響該藥物造模成功的因素很多[4]，如動物品系[5, 6]、性別[7]、體重[8]、給藥途徑[9]、溶媒[10]、給藥劑量[11, 12]、禁食時間[13]等，專家學者對此也進行了廣泛研究探討。其中，溶媒[10]和劑量[8, 11]對腹腔注射ALX致實驗性高血糖小鼠模型的穩(wěn)定性研究通常為注射后7d[14]～30d[15]，針對這一研究現(xiàn)狀，本實驗對腹腔注射ALX致實驗性高血糖小鼠模型建立的溶媒及劑量因素進行優(yōu)化組合，對小鼠成模率、存活率、體重、空腹血糖、血糖曲線下面積(反映糖耐量水平)的穩(wěn)定性進行了長達6周的動態(tài)觀察，同時測定血清胰島素水平及其組間差異，以期為輔助降血糖功能試驗評價及實驗性高血糖相關機制研究提供實驗支持。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級昆明種成年小鼠160只，雌雄各半，6～8周齡，體重22～28 g，自由采食與飲水，由湖北省疾病預防與控制中心動物中心提供，生產(chǎn)合格證號為：SCXK(鄂)2008-0005，實驗動物使用合格證號SYXK(鄂)2007-0042。

1.2 試劑與儀器

四氧嘧啶、葡萄糖、檸檬酸及檸檬酸鈉(分析純，Sigma，美國)，生理鹽水(雙鶴，中國)。安準型血糖檢測儀及試紙條(長沙三諾，中國)，小鼠胰島素ELISA檢測試劑盒(上海博谷，中國)，高速離心機(Thermo，美國)，酶標儀(Thermo，美國)，電子天平(上海梅特勒-托利多，中國)。

1.3 動物分組與干預方法

小鼠適應性喂養(yǎng)3 d后隨機分為8組，每組各12只小鼠：A組：生理鹽水(normal saline，NS)對照組(注射NS)；B組：檸檬酸鈉緩沖液(sodium citrate-hydrochloric acid buffer solution，CS)對照組(注射pH 4.5的CS)；C組：NS + ALX 160 mg(注射NS配制的ALX 160 mg/kg 體重)；D組：NS + ALX 190 mg(注射NS配制的ALX 190 mg/kg 體重)；E組：CS + ALX 190 mg(注射pH 4.5的CS配制的ALX 190 mg/kg 體重)；F組：CS + ALX 180 mg(注射pH 4.5的CS配制的ALX 180 mg/kg 體重)；G組：CS + ALX 160 mg(注射pH 4.5的CS配制的ALX 160 mg/kg 體重)；H組：CS + ALX 140 mg(注射pH 4.5的CS配制的ALX 140 mg/kg 體重)。所有組別小鼠適應性喂養(yǎng)3 d后，在造模前禁食不禁水16 h后檢測體重、空腹血糖及血糖曲線下面積的基礎值，然后采取單次腹腔注射(溶劑或藥物，0.2 mL/kg 體重)進行造模，ALX配制均避光、現(xiàn)用現(xiàn)配。血糖高于10 mmol/L者確定為造模成功，計算各組成模率。所有組別小鼠繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)，動態(tài)檢測體重、空腹血糖及血糖曲線下面積，1次/周，共6周，觀察結(jié)束后收集小鼠血清保存于-20℃用于檢測血清胰島素水平。

1.4 小鼠血清胰島素水平檢測

實驗步驟嚴格按照小鼠胰島素ELISA檢測試劑盒提供的說明書進行，顯色終止后于450 nm波長處測定吸光度值，繪制標準曲線，計算相對濃度值，用于統(tǒng)計分析。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠存活率動態(tài)觀察

如圖1中所示，NS腹腔注射組或與ALX 160 mg/kg 體重配伍腹腔注射組，造模后6 周小鼠存活率穩(wěn)定在100%；NS與ALX 190 mg/kg 體重配伍腹腔注射組及CS腹腔注射組，造模后小鼠存活率6 周穩(wěn)定在90%；CS與ALX 190 mg/kg 體重配伍腹腔注射組，造模后1 周小鼠存活率為67%，2～6 周逐步下降至47%，與NS對照組相比顯著下降，P<0.05；CS與ALX 180 mg/kg 體重配伍腹腔注射組，造模后1 周小鼠存活率為73%，2～6 周維持穩(wěn)定在67%；CS與ALX 160 mg/kg 體重配伍腹腔注射組，造模后小鼠存活率6 周穩(wěn)定在75%，CS與ALX 140 mg/kg 體重配伍腹腔注射組，造模后小鼠存活率6周穩(wěn)定在70%，組間存活率相比無顯著性差異，P>0.05。

2.2 小鼠成模率動態(tài)觀察

如圖2所示，NS腹腔注射組或CS腹腔注射組，造模后6周小鼠成模率為0；NS與ALX 160 mg/kg 體重配伍腹腔注射組，造模后小鼠1周成模率為0，2～6周為7%；NS與ALX 190 mg/kg 體重配伍腹腔注射組，造模后2周小鼠成模率由0上升至40%，第3周降低至7%，第4周上升至15%，5～6周降低至7%，呈現(xiàn)較大波動；CS與ALX配伍腹腔注射組成模率與NS對照組相比顯著增高，P<0.05，其中，CS與ALX 190 mg/kg 體重配伍腹腔注射組，造模后6周小鼠成模率穩(wěn)定在93%；CS與ALX 180 mg/kg 體重配伍腹腔注射組，造模后1周小鼠成模率為87%，2～6周內(nèi)在67%至87%之間反復波動；CS與ALX 160 mg/kg 體重配伍腹腔注射組，造模后小鼠成模率1周小鼠成模率為70%，2～6周內(nèi)穩(wěn)定保持在60%至70%水平；CS與ALX 140 mg/kg 體重配伍腹腔注射組，造模后1周小鼠成模率為47%，2～6周內(nèi)在47%至27%之間反復波動。

圖1 造模前后各組小鼠存活率動態(tài)變化曲線

圖2 各組小鼠成模率動態(tài)變化曲線

2.3 小鼠體重動態(tài)觀察

如圖3所示6周觀察期內(nèi)，NS腹腔注射或與ALX 160 mg/kg 體重、ALX 190 mg/kg 體重配伍腹腔注射、CS腹腔注射或與ALX 140 mg/kg 體重配伍腹腔注射對小鼠體重及其穩(wěn)定性的影響，與NS對照組相比，差異無顯著性，P> 0.05；與NS對照組相比，CS與ALX 180、190 mg/kg 體重配伍會導致小鼠體重極顯著下降，P<0.01，CS與ALX 160 mg/kg 體重配伍會導致小鼠體重顯著下降，P<0.05。

注：* 與NS對照組相比有顯著性差異，P<0.05；** 與NS對照組相比有極顯著性差異，P<0.01

注：* 與NS對照組相比有顯著性差異，P<0.05；** 與NS對照組相比有極顯著性差異，P<0.01

2.4 小鼠空腹血糖動態(tài)觀察

如圖4所示，造模后，NS對照組及NS+ALX 160 mg組，小鼠空腹血糖未見升高，6周內(nèi)呈持續(xù)穩(wěn)定不變趨勢；NS+ALX 190 mg組、CS對照組造模后小鼠空腹血糖呈一過性輕度升高，3周后下降至正常水平并呈持續(xù)穩(wěn)定不變趨勢；CS+ALX 140 mg組造模后小鼠空腹血糖較NS對照組顯著升高，2-6周呈波動性下降趨勢，至第6周空腹血糖仍顯著高于NS對照組(P< 0.05)；CS+ALX 160 mg組造模后小鼠空腹血糖較NS對照組顯著升高，2～6周呈穩(wěn)定保持高水平(15｀20 mmol/L)，至第6周空腹血糖仍顯著高于NS對照組(P<0.05)；CS+ALX 180 mg組及CS+ALX 190 mg組，造模后小鼠空腹血糖較NS對照組極顯著升高，2～6周呈穩(wěn)定保持極高水平，至第6周空腹血糖仍極顯著高于NS對照組(>25 mmol/L，P<0.01)。結(jié)果提示，6周觀察期內(nèi)，NS腹腔注射或與ALX 160 mg/Kg體重、ALX 190 mg/Kg體重配伍腹腔注射NS、CS腹腔注射對小鼠空腹血糖及其穩(wěn)定性無顯著影響，CS與ALX 160～190 mg/Kg 體重配伍會導致小鼠空腹血糖顯著升高，ALX劑量越大，小鼠空腹血糖越高。

注：* 與NS對照組相比有顯著性差異，P < 0.05；** 與NS對照組相比有極顯著性差異，P < 0.01

2.5 小鼠糖耐量水平動態(tài)觀察

如圖5所示，造模后，NS對照組及NS+ALX 160 mg組，小鼠血糖曲線下面積未見升高，6周內(nèi)呈持續(xù)穩(wěn)定不變趨勢；NS+ALX 190 mg組、CS對照組造模后小鼠血糖曲線下面積呈一過性輕度升高，3周后下降至正常水平并呈持續(xù)穩(wěn)定不變趨勢；CS+ALX 140 mg組造模后小鼠血糖曲線下面積較NS對照組顯著升高，第2周下降，3～6周血糖曲線下面積仍顯著高于NS對照組(P<0.05)；CS+ALX 160 mg組及CS+ALX 180 mg組造模后小鼠血糖曲線下面積較NS對照組極顯著升高，2-6周呈穩(wěn)定保持高水平(55～65 mmol/L)，至第6周血糖曲線下面積仍極顯著高于NS對照組(P<0.01)；CS+ALX 190 mg組，造模后小鼠血糖曲線下面積較NS對照組極顯著升高，2-6周呈穩(wěn)定保持極高水平，至第6周血糖曲線下面積仍極顯著高于NS對照組(P<0.01)。結(jié)果提示，6周觀察期內(nèi)，NS腹腔注射或與ALX 160 mg/Kg體重、ALX 190 mg/kg 體重配伍腹腔注射、CS腹腔注射對小鼠血糖曲線下面積及其穩(wěn)定性無顯著影響，CS與ALX 140～190 mg/kg體重配伍會導致小鼠血糖曲線下面積顯著升高，ALX劑量越大，小鼠血糖曲線下面積越高。

2.6 小鼠血清胰島素水平組間差異

如圖6所示，造模后第6周，NS對照組、CS對照組、NS+ALX 160 mg組、NS+ALX 190 mg組小鼠血清胰島素水平組間無差異；CS+ALX 140 mg組、CS+ALX 160 mg組及CS+ALX 180 mg組小鼠血清胰島素水平組間無差異，均顯著低于NS對照組，P<0.05，CS+ALX 190 mg組小鼠血清胰島素水平極顯著低于NS對照組，P<0.01。提示NS、CS單獨腹腔注射，NS與ALX 160或190 mg/kg 體重聯(lián)合腹腔注射均不會對造模后第6周小鼠血清胰島素水平有顯著影響，而CS與ALX 140、160、180及190 mg/kg 體重聯(lián)合腹腔注射均對造模后第6周小鼠血清胰島素水平有顯著降低作用(P<0.05)，其中以CS與ALX 190 mg/kg 體重聯(lián)合腹腔注射降低血清胰島素水平作用最為顯著(P<0.01)。

注：* 與NS對照組相比有顯著性差異，P<0.05；** 與NS對照組相比有極顯著性差異，P<0.01

3 討論

隨著人們生活水平的不斷提高和人口老齡化，糖尿病的發(fā)病呈逐年上升趨勢。建立理想的實驗性糖尿病動物模型，無論對糖尿病機制的深入研究，還是保健食品及抗糖尿病新藥的開發(fā)都具有非常重要的實際意義。

ALX易與SH基(主要是半胱氨酸)發(fā)生反應，而胰島的β細胞中SH基含量較其他組織多，故ALX可以選擇性地損害胰島β細胞，通過產(chǎn)生超氧自由基破壞β細胞，使細胞內(nèi)DNA損傷，并激活多聚核糖體合成酶的活性，從而導致mRNA功能受損，細胞合成前胰島素減少，最終導致胰島素缺乏性的高血糖[7]。利用ALX制造高血糖模型能高度模擬人類糖尿病臨床表現(xiàn)[2]，同時具有胰島外分泌不受損傷；幾乎所有常用實驗動物都可以進行實驗研究；胰島的β細胞不是功能消失，而是功能不同程度的降低，有利于研究胰島組織的再生和功能的恢復，動物不用注射胰島素也能存活等優(yōu)點而被國際上廣泛采納[16]。

四氧嘧啶造模成功受諸多因素影響，例如動物品系、性別、體重、給藥途徑、溶媒、給藥劑量、禁食時間等，專家學者對此也進行了廣泛研究探討，研究發(fā)現(xiàn)這些因素對造模成功率的影響各異[9, 17]，已報道的實驗結(jié)果中溶媒[10]的選擇、藥物的劑量[8, 11]仍是關鍵的影響因素，文獻中使用ALX造模劑量從100 mg/kg 體重到300 mg/kg 體重(小鼠)[7, 8, 11]均有報道且結(jié)果各異，可能與各文獻中實驗條件各異以及動物個體差異有關[17, 18]。ALX水溶液的穩(wěn)定性取決于pH值，pH 4.5的CS減少ALX的氧化分解有利于藥物的溶解以及在體內(nèi)的吸收利用從而提高成模率[10]。我們的實驗中以pH值為4.5的CS為溶劑配制ALX，并且避光、現(xiàn)用現(xiàn)配。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)全部以此為溶液的組別造模后成模率及其穩(wěn)定性都顯著高于以生理鹽水為溶劑的組別(無論藥物濃度高低)，與文獻報道一致[10]，造模后6周內(nèi)血糖值穩(wěn)定維持在成模水平(>10 mmol/L)，因此我們認為pH值為4.5的CS為溶劑是造模成功及維持模型長期穩(wěn)定性的必要條件。

最重要的是，在輔助降血糖功能試驗評價中，成功構建糖尿病模型是前提，而功能試驗周期一般長達4～6周，因此，保證該模型的穩(wěn)定性，是該項評價工作順利進行的重要保障和前提。目前大多數(shù)文獻僅考察了上述相關因素對造模率等指標7～30d期間的影響[14, 15]。針對這一研究現(xiàn)狀，本實驗對腹腔注射ALX致實驗性高血糖小鼠模型建立的溶媒及劑量因素進行優(yōu)化組合，對小鼠成模率、存活率、體重、空腹血糖、血糖曲線下面積(反映糖耐量水平)的穩(wěn)定性進行了長達6周的動態(tài)觀察，同時測定血清胰島素水平及其組間差異。

我們的實驗結(jié)果表明ALX(以pH值為4.5 CS為溶劑)濃度達到190 mg/kg 體重時，6周內(nèi)成模率(93%)，空腹血糖(>25 mmol/L)及血糖曲線下面積(>70 mmol/L)較持續(xù)穩(wěn)定在高水平，但體重(27g)、動物存活率(47%)及血清胰島素水平(19 mIU/L)極顯著降低(P<0.01)，提示該劑量可能會因動物損耗過大、小鼠胰腺及其胰島分泌胰島素功能被不可逆損害，高血糖狀態(tài)不可逆轉(zhuǎn)而不適用于輔助降血糖功能試驗研究。藥物濃度在140、160、180 mg/kg 體重時，6周內(nèi)小鼠空腹血糖(15～25 mmol/L)及血糖曲線下面積(40～60 mmol/L)動物成模率(40%～73%)、存活率(67%～75%)及體重(29～41g)持續(xù)穩(wěn)定在較高水平，血清胰島素水平(21 mIU/L)顯著降低(P<0.05)，其中尤以160 mg/kg 體重組各項指標最為穩(wěn)定，可用于輔助降血糖功能試驗的研究，而140及180 mg/kg 體重組各項指標波動較大可能會影響試驗結(jié)果的穩(wěn)定性。

綜上，我們的實驗選擇體重22～28 g 的昆明小鼠，禁食16 h，并用pH值為4.5的CS溶解的160 mg/kg 體重 ALX腹腔單次注射，連續(xù)動態(tài)觀察6周，獲得成模率較高、存活率較高、空腹血糖及血糖曲線下面積較持續(xù)穩(wěn)定在成模水平，血清胰島素水平下降但不喪失的糖尿病小鼠模型，可用于實驗性糖尿病的基礎研究及輔助降血糖的功能研究。

我們通過對關鍵因素的不同組合，動態(tài)觀察成模后6周的小鼠成模率、存活率、體重、空腹血糖、糖耐量變化情況，并檢測血清胰島素水平，從穩(wěn)定性及胰島β細胞功能角度來評價組間差異，篩選出造模藥物ALX最適劑量，更具科學性和準確性，為輔助降血糖功能試驗的準確評價提供有力的實驗依據(jù)和保障。

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