劉國棟，劉秀華，白 靜，李瑞生，王 禹

(1.中國人民解放軍總醫(yī)院心血管內(nèi)科，北京 100853；2. 中國人民解放軍第95577部隊醫(yī)院 云南 曲靖 655601；3.中國人民解放軍總醫(yī)院病理生理學研究室，北京 100853；4.中國人民解放軍第302醫(yī)院實驗技術研究保障中心，北京 100039)

血管鈣化是發(fā)生于大中動脈血管壁鈣鹽的過度沉積的異位鈣化現(xiàn)象，是動脈粥樣硬化、糖尿病、高血壓病、慢性腎功能不全和衰老等多種疾病的共同病理生理基礎，是心血管疾病的一個重要危險因子[1]。發(fā)生血管鈣化的同時往往伴有管壁僵硬、順應性降低、血壓升高、左心室肥厚、心室功能減低等一系列并發(fā)癥狀。白藜蘆醇(resveratrol, Res)是一種非黃酮類多酚化合物，存在于葡萄科、百合科、豆科等多種植物中，在葡萄中的含量尤為豐富。法國人日常攝入大量脂肪，但心血管疾病的發(fā)病率與死亡率都明顯低于歐洲其他國家的“法國悖論”現(xiàn)象，主要與其日常飲用葡萄酒相關[2]，白藜蘆醇可能是其主要的功能因子。然而白藜蘆醇對血管鈣化大鼠的血壓和心臟功能的影響研究尚未見報道，本實驗擬利用維生素D3和尼古丁建立血管鈣化模型，并在此基礎上觀察白藜蘆醇對鈣化大鼠血壓、心臟功能、血管結構以及主動脈和血清堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性的影響,為今后研究心血管疾病的預防及治療提供可靠的實驗數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選擇32只SD大鼠，雄性，8周齡，單鼠體質(zhì)量180 ～200 g，購于軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，生產(chǎn)許可證[ SCXK(軍)2012-0004 ]。動物實驗在解放軍第302醫(yī)院SPF級動物實驗設施內(nèi)完成，實驗動物使用許可證[ SYXK(軍)2012-0010 ]。

1.2 主要試劑與器材

白藜蘆醇和維生素D3購自Sigma公司；尼古丁為Sigma公司產(chǎn)品由北京大學醫(yī)學部齊永芬教授饋贈；ALP測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所；多通道生物信號采集處理系統(tǒng)(RM6240BD)為成都儀器廠生產(chǎn)。

1.3 大鼠鈣化模型的制備

大鼠鈣化模型的制備在Niederhoffer等[3-4]方法的基礎上加以改進。大鼠適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為對照組(Con)、鈣化組(Cal)、白藜蘆醇低劑量處理組(Cal+Res[L])和高劑量處理組(Cal+Res[H])，每組各8只。(1)Con組上午8時給予等量生理鹽水和單純花生油灌胃；(2)Cal組：第1日上午8時維生素D3( 300 000 U/kg ) 肌肉注射加尼古丁( 25 mg/kg )溶于5 m L花生油灌胃，下午6時重復灌胃1次；(3)Cal+Res[L]組：在 Cal組的基礎上，從第2日開始每天給予25 mg/( kg·d )的白藜蘆醇灌胃；(4)Cal+Res[H]組：在 Cal組的基礎上，從第2日開始每天給予50 mg/( kg·d )的白藜蘆醇灌胃；除外Con組，其它三組大鼠第3周后末重復維生素D3肌注1次，各組動物均常規(guī)飼養(yǎng)6周后進行下述檢測。

1.4 血壓和心臟功能相關指標的測定

術前禁食過夜，自由飲水，稱重，腹腔注射戊巴比妥鈉進行麻醉。 參照王艷飛等[5]方法，固定后分離并暴露右側頸總動脈，將肝素鈉浸潤的導管(PE-50)插入右頸總動脈經(jīng)壓力傳感器與多通道生物信號采集處理系統(tǒng)相連，手術后穩(wěn)定15 min，記錄頸動脈波形，將導管繼續(xù)向前推進，屏幕上接著出現(xiàn)振幅高大、波寬較大的室內(nèi)壓變化的波形，表示導管已經(jīng)進入左心室。波形穩(wěn)定后，記錄左心室壓力曲線，系統(tǒng)自帶軟件分析數(shù)據(jù)。測定完成后打開胸腔分離心臟，剪取左心室部分并稱重。

1.5 血清和主動脈ALP 活性測定

腹主動脈采集全血，取2 mL，4℃，3 000 r/min離心15 min，收集上層血清。取約10 mg胸主動脈，以等滲PBS制備組織勻漿，4℃ 8 000 r/min離心10 min，吸取上清液，考馬斯亮藍法進行蛋白含量測定；按照ALP測定試劑盒說明書測定血清和主動脈ALP活性， 根據(jù)在波長405 nm處測定4-硝基酚的生成速率，計算出ALP的活性，其中主動脈ALP活性用蛋白含量進行標準化處理。

1.6 HE染色

取胸主動脈約1cm，用4%中性甲醛溶液固定，常規(guī)進行石蠟包埋、切片、HE染色和中性樹膠封固，最后顯微鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 一般情況

Cal組和白藜蘆醇處理組大鼠從造模后第1天，出現(xiàn)嗜睡，震顫，厭食，1周后癥狀明顯減輕。實驗結束后，各組體重出現(xiàn)差異，與Con組比較，Cal組大鼠體重減輕6.9%(P<0.05)，與Cal組比較，Cal+Res[L]組和Cal+Res[H]組體重分別增加3.7%和5.0%(均P<0.05)。(表1)

2.2 血壓和心功能指標分析

與Con組比較，Cal組大鼠的LVW/BW、HR、SAP、PP、MBP 和LVSP分別升高了27.3%(P<0.01)、8.8%(P<0.05)、22.8%(P<0.01)、47.5%(P<0.01)、13.6%(P<0.01)和19.0%(P<0.01)，Cal組大鼠的DAP、LVEDP和 ±LV dp/dtmax沒有明顯變化(均P>0.05)；與Cal組比較，Cal+Res[L]組的PP8.5%(P<0.05)，LVW/BW HR、SAP、DAP、MBP、LVSP、LVEDP和±LV dp/dtmax沒有明顯變化(均P>0.05)；與Cal組比較，Cal+Res[H]組的LVW/BW、SAP、PP、MBP和LVSP分別降低14.2%(P<0.05)、13.6%(P<0.01)、23.7%(P<0.01)、10.0%(P<0.01)和9.0%(P<0.01)，HR、DAP、LVEDP和 ±LV dp/dtmax沒有明顯變化(均P>0.05)；與Cal+Res[L]組比較，Cal+Res[H]組的SAP、PP和LVSP分別降低8.3%(P<0.05)、16.7%(P<0.01)和5.8%(P<0.05)，LVW/BW、HR、DAP、MBP、LVEDP和±LV dp/dtmax沒有明顯變化(均P>0.05)。(表1)

表1 大鼠體重、血壓和心功能指標

2.3 血清和主動脈ALP活性的變化

與Con比較，Cal組大鼠血清和主動脈ALP活性分別增高280%和265%(均P<0.01)；與Cal組比較，Cal+Res[L]組血清和主動脈ALP活性分別降低34.5%和29.5%(均P<0.01)；與Cal組比較，Cal+Res[H]組血清和主動脈ALP活性分別降低53.1%和45.9%(均P<0.01)；與Cal+Res[L]組比較，Cal+Res[H]組血清和主動脈ALP活性分別降低28.4%和23.2%(均P<0.01)。(圖1)

注：(n = 6)數(shù)據(jù)采用表示，與Con比較**P < 0.01，與Cal組比較，##P < 0.01，與Cal+Res[L]組比較，△△P<0.01。

2.4 主動脈HE染色結果

HE染色顯示，與Con組比較，Cal組大鼠主動脈平滑肌細胞大量增殖，管壁厚度明顯增加，彈力纖維排列紊亂。與Cal組大鼠比較，Cal+Res[L]組和Cal+Res[H]組大鼠主動脈平滑肌細胞增殖減少，管壁厚度減小，彈力纖維排列紊亂程度明顯減輕，主動脈中膜纖維排列有序，層次分明，著色均勻 (圖2，見文后彩插1)

3 討論

血管鈣化是許多心血管疾病的重要特征之一，根據(jù)鈣化在血管壁發(fā)生的部位不同，血管鈣化可分為內(nèi)膜鈣化和中膜鈣化。內(nèi)膜鈣化主要發(fā)生于大血管和冠狀動脈，與內(nèi)膜增生和粥樣斑塊形成有關，促進了冠狀動脈粥樣硬化性疾病的進展。中膜鈣化，即Monckeberg鈣化，主要發(fā)生在糖尿病和慢性腎功能不全的患者，會導致管壁僵硬度增加，順應性降低，冠脈血流灌注不足，左心室肥厚，最終發(fā)展為充血性心力衰竭。

大劑量的維生素D3可以使血管的彈力纖維降解，使體內(nèi)的鈣、磷沉積到血管組織，維生素D3還可以激活血管平滑肌細胞維生素D受體，促進細胞對鈣的吸收，誘導成骨因子的表達[6]。尼古丁可以增強維生素D3的作用，兩者合用可以引起動脈鈣超載，引起中膜鈣沉積，最終導致血管鈣化。ALP是骨礦化過程中的關鍵酶，血管平滑肌細胞可在各種致鈣化因素作用下ALP表達，且酶活性顯著增加，血管鈣化過程中，成骨細胞分泌ALP和鈣晶體到細胞外基質(zhì)，ALP能夠提供底物促進羥磷灰石結晶生成和局部磷酸含量的升高，ALP可以促進血管平滑肌細胞鈣化和磷的釋放，通過降低ALP活性可以阻止血管鈣化。本實驗用大劑量的維生素D3和尼古丁建立了6周的血管鈣化模型，結果發(fā)現(xiàn)Cal組大鼠血清和血管組織ALP活性較Con組明顯升高，而白藜蘆醇處理組大鼠血清和主動脈ALP活性較Cal組降低，表明白藜蘆醇可能具有一定的預防血管鈣化的作用[7]。

目前，我國已經(jīng)步入老齡化社會，隨著年齡的增長，高血壓病患病率越來越高，而高血壓病人較早出現(xiàn)的心臟結構改變是左心室肥厚。我們在誘導血管鈣化的同時發(fā)現(xiàn)Cal組大鼠的LVW/BW、HR、SAP、PP、MBP和LVSP明顯升高[8-9]，可能是由于血管鈣化大鼠血管管壁僵硬度增加，順應性降低并最終導致了血壓升高和左心室的肥厚。與Cal組比較，Cal+Res[H]組的LVW/BW、SAP、PP、MBP和LVSP明顯下降，說明白藜蘆醇具有降低血壓，逆轉心室肥厚和改善心臟功能的作用。HE染色結果顯示：與Cal組大鼠比較，白藜蘆醇處理組抑制了鈣化血管平滑肌細胞的增殖，減小了管壁厚度[10]，同時彈力纖維排列紊亂程度也明顯減輕，與血流動力學指標變化相一致。

血管內(nèi)皮細胞在調(diào)節(jié)血管收縮和舒張過程中起著重要作用，血管內(nèi)皮細胞通過釋放血管活性多肽(ET)收縮血管并促進內(nèi)皮細胞增殖，同時釋放一氧化氮(NO)舒張血管并抑制內(nèi)皮細胞增殖。生理條件下，ET與NO處于動態(tài)平衡，使血管張力保持正常，病理條件下，ET與NO動態(tài)平衡被打破，白藜蘆醇的降壓作用的機制可能是由于其具有調(diào)節(jié)ET與NO兩者生成，并增強NO的活性得以實現(xiàn)[11-12]。白藜蘆醇還能夠使環(huán)氧合酶Cox-1失活，上調(diào)NO信號通路來抑制血栓素TxA2合成， 減少具有強效血管收縮作用的內(nèi)皮縮血管肽的生成[13]。在腹主動脈縮窄大鼠模型，白藜蘆醇可以通過激活eNOS/NO信號通路逆轉壓力負荷誘導的心室肥厚和功能障礙[14]。在小鼠高血壓模型，平滑肌細胞的增殖使管壁的順應性降低，而白藜蘆醇能夠阻止年齡依賴的主動脈彈性能力的退化[11]，這可能是由于抑制了血管緊張素II誘導的平滑肌細胞增殖[15]。

白藜蘆醇是一種具有廣泛生理和藥理學作用的化合物，具有改善血管內(nèi)皮功能、舒張血管、抑制血管炎癥反應、抑制血小板聚集和血栓形成、抗動脈粥樣硬化、抗氧化應激、抗血管內(nèi)皮細胞凋亡等多種心血管保護作用，而且經(jīng)口服后能迅速被機體吸收、分布和代謝，具有較高的研究和應用價值。本研究首次通過維生素D3和尼古丁誘導的大鼠血管鈣化模型的基礎上觀察到白藜蘆醇具有降低血壓和改善心臟功能的作用，為白藜蘆醇的心血管疾病的防治提供了新的研究思路。

參考文獻：

[1] Manivannan J, Barathkumar TR, Sivasubramanian J, et al. Diosgenin attenuates vascular calcification in chronic renal failure rats [J]. Mol Cell Biochem, 2013, 378(1-2): 9-18.

[2] Wu JM, Hsieh TC. Resveratrol: a cardioprotective substance [ J ]. Ann N Y Acad Sci. 2011, 1215: 16-21.

[3] Niederhoffer N, Bobryshev YV, Lartaud-Idjouadiene I, et al.Aortic calcification produced by vitamin D3 plus nicotine[J].J Vase Res, 1997, 34(5):386-398.

[4] 楊曉玲, 張大軍, 梁軍, 等. 實驗性血管鈣化大鼠血漿的抗氧化能力的研究 [J]. 中國比較醫(yī)學雜志, 2006, 16(11): 668-670.

[5] 王艷飛, 曹雪濱, 崔英凱, 等. 改良大鼠左心室插管術及心衰大鼠左心功能指標的測定 [J]. 中國比較醫(yī)學雜志, 2008, 18(12): 34-36.

[6] Rajasree S, Umashankar PR, Lal AV, et al. 1,25-dihydroxyvitamin D3receptor is upregulated in aortic smooth muscle cells during hypervitaminosis D [J]. Life Sci, 2002, 70(15): 1777-1788.

[7] Emily J, Tomayko, Andrea J, et al. Resveratrol supplementation reduces aortic atherosclerosis and calcification and attenuates loss of aerobic capacity in a mouse model of uremia [J]. J Med Food, 2014, 17(2): 278-283.

[8] Zhou YB, Jin SJ, Cai Y, et al. Lanthanum acetate inhibits vascular calcification induced by vitamin d3plus nicotine in rats [J]. Exp Biol Med (Maywood) , 2009, 234 (8): 908-917.

[9] Sui YB, Chang JR, Chen WJ, et al. Angiotensin-(1-7) inhibits vascular calcification in rats [J]. Peptides, 2013, 42: 25-34.

[10] Haider UG, Roos TU, Kontaridis MI, et al. Resveratrol inhibits angiotensin II and epidermal growth factor mediated Akt activation: role of Gab1 and Shp2 [J]. Mol Pharmacol, 2005, 68(1): 41-48.

[11] Pearson KJ, Baur JA, Lewis KN, et al. Resveratrol delays age-related deterioration and mimics transcriptional aspects of dietary restriction without extending life span [J]. Cell Metab, 2008, 8(2): 157-168.

[12] Nicholson SK, Tucker GA, Brameld JM. Effects of dietary polyphenols on gene expression in human vascular endothelial cells [J]. Proc Nutr Soc, 2008, 67(1): 42-47.

[13] Shen MY, Hsiao G, Liu CL, et al. Inhibitory mechanisms of resveratrol in platelet activation: pivotal roles of p38 MAPK and NO/cyclic GMP [J]. Br J Haematol, 2007, 139(3): 475-485.

[14] Juric D, Wojciechowski P, Das DK et al. Prevention of concentric hypertrophy and diastolic impairment in aortic-banded rats treated with resveratrol [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2007, 292(5): H2138-2143.

[15] Zhang XW, Wang Y, Yang WW, et al. Resveratrol inhibits angiotensin II-induced ERK1/2 activation by downregulating quinone reductase 2 in rat vascular smooth muscle cells [J]. J Biomed Res, 2012, 26( 2 ): 103-109.