田 欣，王 晶，趙芯晨，周小超，閆 峰，何婧瑜，郭德玉

(首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院，北京 100053)

心跳呼吸驟停是臨床常見的急危重癥。據(jù)美國心臟病協(xié)會及卒中委員會統(tǒng)計結(jié)果，美國2008 年有院外心跳驟停166,200名患者，40,000名患者心肺復蘇(cardiopulmonary resuscition，CPR)成功后進入ICU 接受進一步治療，超過50%的患者遺留嚴重神經(jīng)功能障礙[1]。我國僅據(jù)2008 年阜外醫(yī)院國家“十一五”課題結(jié)果顯示：中國每年約54.4萬人因心源性“猝死"需進行CPR[2]。心臟驟停 (cardiac Arrest，CA)和心肺復蘇是復雜的病理生理變化過程。許多發(fā)病機制尚不清楚．由于臨床研究受多方面因素的干擾，深入研究CPR的病理生理機制受到一定限制。動物模型是較為理想的載體模型，能夠?qū)Ω鞣N混雜因素進行嚴格控制，并且實驗結(jié)果具有可重復性。因此建立一個良好的動物模型，可為人類疾病發(fā)病機制的研究提供實驗平臺。作為如何減輕CPR 后患者神經(jīng)功能障礙，促進神經(jīng)功能的恢復的基礎(chǔ)研究：制備一種穩(wěn)定可靠的動物模型，在當前是應該首要解決的。

1 材料和方法

1.1 藥品試劑與儀器

0.1%鹽酸腎上腺素注射液 (天津金縷氨基酸有限公司，批號：0508201),0.9%生理鹽水注射液(天津百特醫(yī)療用品有限公司),肝素鈉注射液(江蘇常州升華千紅制藥有限公司),恩弗烷(河北九派制藥有限公司 Enflurane)。

電生理刺激器(日本光電，SEN-3301)，食道電極(江蘇電子儀器廠)，小動物麻醉罐(美國NatureGene Corp，tech3)，小動物呼吸機(美國Harvard，MA1 55-7058)，多導生理記錄儀(美國BIOPAC，MP150)，電子天平(美國OHAUS)，顯微鏡(Olympus，DP70)。

1.2 實驗動物與分組

SPF 級SD雄性大鼠，2月齡16只，4月齡16只,北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供【SCXK(京)2012-0001】，飼養(yǎng)在宣武醫(yī)院動物房【SYXK(京)2010-0013】。動物隨機分組：(1)4月齡假手術(shù)組(OC組，n=8)；2月齡假手術(shù)組(YC，n=8)(2)4月齡心肺復蘇模型組(OM組，n=8)；2月齡心肺復蘇模型組(YM組，n=8))。

1.3 經(jīng)食管心臟起搏誘發(fā)室顫

大鼠術(shù)前不禁食，顯微鏡下經(jīng)口氣管插管，插入16 g套管接小動物呼吸機，持續(xù)以1%～2%恩弗烷聯(lián)合30%氧氣、70%N2O混合吸入全麻。分離左側(cè)股動靜脈：經(jīng)股動脈插入PE50管接MP150生理記錄儀血壓測量系統(tǒng)，監(jiān)測動物血壓改變；經(jīng)股靜脈插管，開放靜脈給藥通道；經(jīng)四肢皮下針記錄標準Ⅱ?qū)?lián)心電圖,動態(tài)監(jiān)測動物心電圖改變；經(jīng)肛門監(jiān)測肛溫，維持體溫37℃±0.5℃。

4極5F起搏電極經(jīng)口插入食管約7 cm ,電極近端與刺激輸出端相連。測定心室起搏閾值,誘發(fā)室顫電壓應高于起搏閾值6～8V(28～36V)，頻率20～30 Hz，脈寬10 ms。超速起搏，直至大鼠室顫、心跳停搏、逸搏等持續(xù)存在，血壓小于25 mmHg，正常的脈搏波形消失，提示誘導室顫成功，停止起搏。6 min后進行CPR：經(jīng)股靜脈注射腎上腺素40 μg/ kg；打開小動物呼吸機，根據(jù)大鼠體重由呼吸機自動設(shè)定通氣頻率,潮氣量為6 mL/kg；人工手法行胸外心臟按壓,頻率200次/min，按壓深度為大鼠胸廓前后徑1/ 3。持續(xù) 3 min，未復蘇大鼠進行5J非同步電除顫；總復蘇時間超過15 min剔除。大鼠恢復室上性心率，收縮壓超過60 mmHg并持續(xù)10 min以上，認為復蘇成功。實驗全程監(jiān)測心電和血壓，超出規(guī)定范圍者剔除。

1.4 室顫過程中生理指標的監(jiān)測

不同月齡的SD大鼠電刺激過程中血壓的監(jiān)測比較。不同月齡SD大鼠致CA過程中持續(xù)電刺激時間、CPR時間與血壓變化的統(tǒng)計。

1.5 各組大鼠不同時間段神經(jīng)功能缺失評分(neurologic deficit scores，NDS)

按照心肺復蘇后國際通用的80分NDS評分[3-4]細則，復蘇前3 d評價大鼠神經(jīng)功能，剔出NDS最好或最差的大鼠；ROSC后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d，由受專業(yè)訓練的兩個實驗員對各組SD大鼠采用雙盲法進行獨立評分，最終NDS評分取兩者平均值。

1.6 各組大鼠不同時間段復蘇組神經(jīng)功能亞組評分：

選取平衡木實驗，網(wǎng)格實驗，懸崖回避實驗進一步評估動物運動協(xié)調(diào)能力，選取疼痛刺激實驗進一步評價感覺功能。復蘇前3 d評價大鼠神經(jīng)功能，剔出NDS最好或最差的大鼠；ROSC 后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d，由受專業(yè)訓練的兩個實驗員對各組SD大鼠采用雙盲法進行獨立評分，最終NDS評分取兩者平均值。

1.7 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 不同月齡的SD大鼠電刺激過程中血壓的監(jiān)測比較

經(jīng)食道電刺激致CA過程中，2月齡大鼠血壓維持在80～90 mmHg不變，直到CA出現(xiàn)血壓驟降至25 mmHg(圖1)；而4月齡大鼠血壓從電刺激初期到CA出現(xiàn)一直維持在40～50 mmHg，CA出現(xiàn)時血壓驟降至20 mmHg以下，甚至直線。(圖2)。

2.2 不同月齡SD大鼠的成模率及死亡率統(tǒng)計：

4月齡組8只大鼠，成模7只，成模率87.5%，死亡1只，死亡率12.5%，；2月齡組大鼠成模5只，成模率62.5%，死亡1只，死亡率12.5%。

2.3 不同月齡SD大鼠誘發(fā)CA過程中持續(xù)電刺激時間、CPR時間與血壓變化的統(tǒng)計(表1)

在電刺激誘發(fā)CA過程中，4月齡組大鼠與2月齡組大鼠電刺激前血壓無顯著差異的情況下，誘發(fā)CA的總時間，以及發(fā)生CA進行復蘇搶救的時間無顯著差異；而在此過程中造成的血壓變化，有極顯著性差異(P< 0.01)。

2.4 各組大鼠復蘇后 6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d神經(jīng)功能評分NDS(neurologic deficit scores)的情況：(表2)

在NDS總評分中，兩個月齡的模型組與對照組之間比較6 h、12 h、24 h、48 h、72 h評分均有顯著性差異(P< 0.05)，7 d無顯著性差異。

在NDS總評分中，OC組(4月齡假手術(shù)組)與YC組(2月齡假手術(shù)組)之間相比較，6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d評分均無顯著性差異；OM組(4月齡心肺復蘇模型組)與YM組(2月齡心肺復蘇模型組)之間相比較6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d評分均無顯著性差異。

2.5 各組大鼠復蘇后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d NDS亞組評分結(jié)果分析：

2.5.1 各組大鼠復蘇后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d網(wǎng)格實驗評分結(jié)果(表3)：

在網(wǎng)格實驗中，兩個月齡的模型組與對照組之間比較6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d評分均有顯著性差異(P< 0.05)；不同月齡的對照組之間比較6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d評分均無顯著性差異；不同月齡的模型組之間比較6 h、12 h、24 h、48 h評分有顯著性差異(P< 0.05)，72 h、7 d評分無顯著性差異。

表1 2月齡心肺復蘇模型組(YM組)與4月齡心肺復蘇模型組(OM組)大鼠電刺激與血壓變化

圖1 YM組大鼠電刺激過程中血壓變化不明顯

圖2 OM組大鼠電刺激過程中血壓維持低灌注狀態(tài)

表2不同月齡組大鼠各時間點NDS評分結(jié)果

Tab.2The NDS score of rats at different ages group

注：神經(jīng)功能評分，OM組與OC組相比：*P < 0.05，**P < 0.01；YM組與YC組相比：◆P < 0.05，◆◆P < 0.01。

表3 不同月齡組大鼠各時間點網(wǎng)格實驗評分結(jié)果

2.5.2 各組大鼠大鼠復蘇后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d平衡木實驗評分結(jié)果(表4)：在平衡木實驗中，不同月齡的模型組與對照組6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d評分均有顯著性差異(P< 0.05)；不同月齡的對照組6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d評分均無顯著性差異；不同月齡的模型組6 h、12 h、24 h評分有顯著性差異(P< 0.05)，48 h、72 h、7 d評分無顯著性差異。

表4 不同月齡組大鼠各時間點平衡木實驗評分結(jié)果

2.5.3 各組大鼠大鼠復蘇后6 h、12 h、24 h、48h、72 h、7 d懸崖回避實驗評分結(jié)果(見表-5)：在懸崖回避實驗中，2月齡組大鼠模型組與對照組6 h評分有顯著性差異(P< 0.05)，而12 h、24 h、48 h、72 h、7 d評分無顯著性差異；4月齡組大鼠模型組與對照組6 h、12 h、24 h、48h、72 h、7 d評分無顯著性差異。不同月齡的對照組6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d評分均無顯著性差異；不同月齡的模型組6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d評分無顯著性差異。

表5 不同月齡組大鼠各時間點懸崖回避實驗評分結(jié)果

表6 不同月齡組大鼠各時間點疼痛刺激實驗評分結(jié)果

2.5.4 各組大鼠大鼠復蘇后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d疼痛刺激實驗評分結(jié)果(表6)：在疼痛刺激實驗中，2月齡組大鼠模型組與對照組6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d均有顯著性差異(P< 0.05)，4月齡組大鼠模型組與對照組12 h、24 h、48 h、72 h有顯著性差異(P< 0.05),7 d評分無顯著性差異。

不同月齡的對照組6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d評分均無顯著性差異；不同月齡的模型組6 h、12 h有顯著性差異(P< 0.05)，而24 h、48 h、72 h、7 d評分無顯著性差異。

3 討論

目前，心肺復蘇領(lǐng)域的實驗研究大多基于兩種方法的動物模型：窒息法與電刺激誘發(fā)竄顫法致心搏驟停。國內(nèi)的研究較多采用窒息法模型[5-6]，而國外的研究多采用室顫法動物模型[7]。心肺復蘇動物模型的制作方法有難有易，應根據(jù)實驗目的、實驗室具備的條件(設(shè)備、技術(shù)力量)、實驗經(jīng)費等綜合分析，選擇最適宜的動物模型。自Utstein-Style指南頒布以來，心臟驟停動物模型實驗研究及文獻報道已逐步規(guī)范與統(tǒng)一通過Utstein-Style指南對各心臟驟停動物模型實驗研究的總體引導，統(tǒng)一化、標準化各種動物模型的制作方法和評估參數(shù)，反復驗證各種方法的可行性和可重復性，實驗研究者們可以選擇到一種與各自研究的疾病有最為相似的病理生理學改變和血流動力學變化，與臨床病例有良好相關(guān)性的最佳動物模型。

CPR后，腦損傷的病理生理過程其實質(zhì)是腦缺血缺氧再灌注損傷的過程，病理機制涉及到：微循環(huán)障礙、自由基損傷、興奮性氨基酸中毒、鈣超載及神經(jīng)元信號轉(zhuǎn)導通路異常等各種因素相互促進，導致神經(jīng)元死亡，引起神經(jīng)功能障礙[8]。

當前研究發(fā)現(xiàn)，實驗動物模型多利用血管夾閉或窒息等方法制備全腦缺血再灌注模型研究神經(jīng)損傷的機制，與心源性心跳驟停相比它們在病理生理過程上存在較大差異，實驗結(jié)論不能完全共用[9-10]；在研究內(nèi)容方面，大多數(shù)研究僅限于對神經(jīng)元存活、代謝、功能等某一方面的作用，對CPR 后神經(jīng)保護方面的綜合評價，研究極少。

理想的動物模型將盡可能反映出臨床病理生理變化過程，這對于心肺復蘇研究質(zhì)量有重要意義。本研究應用交流電生理刺激儀經(jīng)食道調(diào)搏誘發(fā)大鼠心搏驟停模型，意在尋找更簡單、更接近臨床實際的研究模型。

本實驗選用經(jīng)食道起搏誘發(fā)室顫制備大鼠心肺復蘇模型，擬對比分析2月齡與4月齡大鼠型在復蘇過程中各項監(jiān)測指標的變化，并分析監(jiān)測指標；以及CPR 后各時間點NDS 及亞組評分的情況，試圖綜合評價不同月齡大鼠制備心肺復蘇模型的可行性與，為臨床治療提供穩(wěn)定有效的模型平臺。旨在找到更適合制備心肺復蘇大鼠模型的動物條件，尋求一種穩(wěn)定性高實用性強的心肺復蘇大鼠模型，為動物模型建立的標準化及進一步深入研究奠定基礎(chǔ)。

本實驗利用4～6 min室顫法制備大鼠心肺復蘇模型，在熟練掌握心肺復蘇模型制作方法的基礎(chǔ)上，考慮月齡較低的年輕大鼠心臟停跳后自身轉(zhuǎn)復率極高，且立即恢復心跳、血壓的特點，選用了常規(guī)實驗用大鼠體重范圍在300 g左右的2月齡大鼠以及4月齡大鼠進行對比研究，發(fā)現(xiàn)2月齡組大鼠電刺激致室顫過程中的血壓初始降到88.57±8.52 mmHg并維持在70.71±22.81 mmHg且波動范圍很大，血壓值不能很好地穩(wěn)定在一個數(shù)值上；而4月齡組大鼠的血壓初始降到47.50±5.98 mmHg并在13.50±9.38 mmHg的范圍內(nèi)平穩(wěn)維持，我們推測4月齡組大鼠在致顫過程中更好的實現(xiàn)了低血壓維持，同時4月齡組大鼠在低血壓維持的基礎(chǔ)上，更易致顫且能在規(guī)定時間范圍內(nèi)成功復蘇，成模率遠高于2月齡組大鼠。而2月齡組大鼠血壓在致顫過程中始終持續(xù)保持在正常血壓值的80%范圍內(nèi)，直至出現(xiàn)心搏驟停血壓才會驟降到25 mmHg。由此推斷，由于大鼠的生存時間在2～3年，故僅與常規(guī)選用的2月齡大鼠而言，只相差2個月的4月齡大鼠，心臟功能存在一定差異，在制備心肺復蘇模型上有一定的優(yōu)勢，穩(wěn)定，易操作，可控性強。

本實驗進一步發(fā)現(xiàn)：2月齡大鼠與4月齡大鼠相比較： 模型組6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d的NDS總評分無顯著性差異。而神經(jīng)功能亞組評分：在網(wǎng)格實驗中4月齡與2月齡大鼠6 h、12 h、24 h、48 h評分有統(tǒng)計學意義而72 h、7 d無統(tǒng)計學意義。在平衡木實驗中6 h、12 h、24 h 4月齡與2月齡大鼠有統(tǒng)計學意義而48 h、72 h、7 d無統(tǒng)計學意義。在懸崖回避實驗中4月齡與2月齡大鼠均無統(tǒng)計學意義。在疼痛刺激實驗中，4月齡與2月齡大鼠6 h、12 h有統(tǒng)計學意義而24 h、48 h、72 h、7 d無統(tǒng)計學意義。根據(jù)以上結(jié)果推斷：NDS總評分不能夠準確反應大鼠腦損傷的程度，需利用神經(jīng)亞組評分或發(fā)掘其他方法進一步評價神經(jīng)功能損失。大鼠心肺復蘇后24 h，運動平衡功能缺失的評價中4月齡組大鼠評分顯著低于2月齡組大鼠，感覺功能缺失的評價中，也存在4月齡組大鼠評分顯著低于2月齡組大鼠的現(xiàn)象，此特征進一步提示我們4月齡組大鼠在致室顫過程中的低血壓維持狀態(tài)，造成的低灌注狀態(tài)，會加重腦損傷程度，從而體現(xiàn)在亞組神經(jīng)功能評分上；且進行心肺復蘇模型的神經(jīng)功能缺失評價時，神經(jīng)功能亞組評分是很有必要的。

參考文獻：

[1] Xiaofeng Jia, Matthew A. Koenig,etal. Post-cardiac arrest temperature manipulation alters early EEG bursting in rats[J]. Resuscitation,2008,78: 367-373.

[2] 胡大一. 推動AED任重而道遠[J].臨床心電學雜志.2008,17(4):244-245.

[3] Xiaofeng Jia, Matthew A Koenig, Robert Nickl,etal. Earlyelectrophysiologic markers predict functional outcomeassociated with temperature manipulation after cardiac arrest in rats[J]. Crit Care Med,2008,36(6):1909-1916.

[4] Romergryko G. Geocadin, David L.etal. Neurological recovery by EEG bursting after resuscitation from cardiac arrest in rats[J]. Resuscitation,2002, 55 :193-200.

[5] 王曉紅,方向韶,黃子通. 血紅素氧合酶對復蘇后心功能不全的保護作用[J].中華急診醫(yī)學雜志 2009(04)

[6] 周世方,陳壽權(quán),李章平. 烏司他丁對大鼠心肺復蘇后血清與海馬CAI區(qū)S100β蛋白變化的作用[J].中華急診醫(yī)學雜志 2009(02)

[7] Sun S, Tang W, Song F. The effects of epinephrine on outcomes of normothermic and therapeutic hypothermic cardiopulmonary resuscitation[J]. 2010(11)

[8] Blaine C. White, Jonathon M. Sullivan, Donald J.etal. Brain ischemia and reperfusion: molecular mechanisms of neuronal injury[J]. Journal of the Neurological Sciences , 2000,179:1-33.

[9] C.L Voll and R.N Auer. Insulin attenuateds ischemic brain damage independent of its hypoglycemic effect[J]. Journal of Cerebral blood Flow and Metabolism,1991,11:1006-1014.

[10] J. G. Mileke, C.Taghibiglou, Y. T.Wang. Engogenous Insulin Signaling Protects Cultured Neurons From Oxygen-Glusose depreivation induced cell death[J]. Neuroscience,2006,143 :165-173.