戴紅良， 黃 雷， 賈桂枝， 梁春光， 李 昕， 戚春玲

(遼寧醫(yī)學(xué)院 1護(hù)理學(xué)院, 3生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001； 2錦州市食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧 錦州 121000)

左卡尼汀是位于線粒體膜的機(jī)體內(nèi)源性化合物，主要來源于肝腎合成以及體外的飲食攝入[1-2]。其基本作用是促進(jìn)長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體進(jìn)行β氧化，為機(jī)體供能[3]。除此之外，左卡尼汀還具有顯著的抗氧化活性[4-5]。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，左卡尼汀可顯著抑制過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，其抗凋亡機(jī)制與抑制Ca2+/鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin, CaN)信號級聯(lián)有關(guān)[5-6]。胞漿活化T細(xì)胞核因子3(nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 3, NFATc3)是CaN下游的重要轉(zhuǎn)錄因子。本研究擬通過分析左卡尼汀對H2O2刺激下心肌細(xì)胞內(nèi)NFATc3表達(dá)及分布的變化，進(jìn)一步探討其抗氧化損傷的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1藥物與試劑 左卡尼汀、胰蛋白酶、DMEM低糖培養(yǎng)基T和Hoechst 33258染料均購于Sigma；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料研究所；細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒及BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；NFATc3及β-actin I抗購于Santa Cruz；Lamin B I抗購于Pierce；辣根過氧化物酶(horseradish peroxide, HRP)標(biāo)記的II抗購于Santa Cruz;FITC標(biāo)記的II抗購自北京中杉金橋公司。

1.2動(dòng)物 出生1～3dSprague-Dawley(SD)大鼠乳鼠，雌雄不拘，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物合格證號為SCXK(遼) 2003-0007。

2 方法

2.1心肌細(xì)胞培養(yǎng) 取出生1～3 d SD大鼠乳鼠，開胸取出心臟，用D-Hanks液沖洗3次后剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小的碎塊，在37 ℃條件下，以0.8 g/L胰蛋白酶消化分離細(xì)胞。將消化完畢的細(xì)胞以差速貼壁法進(jìn)行純化后，置于含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合后，換以含0.4%胎牛血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞分組用于實(shí)驗(yàn)。

2.2細(xì)胞核蛋白及漿蛋白提取 取處理完成的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗后用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞后，然后按照核蛋白提取試劑盒步驟提取核蛋白與漿蛋白。

2.3Westernblotting提取細(xì)胞蛋白后，BCA法測定蛋白濃度。取30μg總蛋白，以樣品緩沖液配平上樣體積，沸水煮5min后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，待電泳完成后電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯PVDF膜。用5%脫脂牛奶封閉1h，接著加NFATc3、β-actin及l(fā)aminBI抗4 ℃孵育過夜。以含吐溫20的三羥甲基氨基甲烷緩沖液(Tris-bufferedsalinewithTween20,TBS-T)充分洗膜后，以HRP標(biāo)記的II抗室溫孵育2h。TBS-T洗膜后，化學(xué)發(fā)光法顯色。 利用NIHImageJ1.42軟件對掃描的條帶進(jìn)行灰度分析。

2.4細(xì)胞免疫熒光分析 取處理完成的細(xì)胞，以4%多聚甲醛固定30 min。加入0.2% Triton X-100作用30 min。以2%標(biāo)準(zhǔn)血清室溫封閉1 h。加入NFATc3 I抗于4 ℃孵育過夜。FITC標(biāo)記的II抗室溫孵育1 h。用Hoechst 33258復(fù)染細(xì)胞核，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 左卡尼汀對H2O2刺激下心肌細(xì)胞內(nèi)NFATc3表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，H2O2、左卡尼汀及CaN特異性抑制劑環(huán)孢素A(cyclosporin A, CsA)均不影響NFATc3的表達(dá),見圖1。

Figure 1. Effect of L-carnitine and CsA on NFATc3 expression in rat cardiac myocytes under H2O2 stimulation. Mean±SD.n=3.

2 左卡尼汀對H2O2刺激下胞漿及胞核中NFATc3表達(dá)的影響

與正常組比較，H2O2處理12 h后心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)NFATc3的表達(dá)顯著降低，而其在核內(nèi)的表達(dá)則顯著增加，左卡尼汀及CsA本身并不影響NFATc3在胞漿及胞核的表達(dá)，但這2種藥物預(yù)處理均能顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的上述改變，見圖2。

3 左卡尼汀對H2O2誘導(dǎo)的NFATc3核轉(zhuǎn)位的影響

免疫熒光的結(jié)果顯示， H2O2處理12 h顯著誘導(dǎo)NFATc3由胞漿到胞核的轉(zhuǎn)位；左卡尼汀及CsA本身不影響NFATc3的轉(zhuǎn)位，但這2種藥物均能阻止H2O2的促轉(zhuǎn)位作用，見圖3。

討 論

氧化應(yīng)激是指細(xì)胞內(nèi)氧化及抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致氧化作用過度激活的一種病理狀態(tài)。心肌受到損傷后，活性氧與自由基生成大大增加。已經(jīng)證實(shí)，氧化應(yīng)激在心肌缺血再灌注損傷、糖尿病性心肌病及心肌纖維化等病理過程中發(fā)揮著重要作用[7-9]。而應(yīng)用抗氧化劑往往能夠取得良好效果[10]。

在正常的生理狀態(tài)下，Ca2+是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使。而在病理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)的Ca2+異常升高(Ca2+超載)則會對細(xì)胞帶來嚴(yán)重?fù)p傷。已有研究證實(shí)，活性氧/氮應(yīng)激可以通過改變細(xì)胞內(nèi)正常的Ca2+穩(wěn)態(tài)過程，最終誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[11]。在之前的研究中我們也發(fā)現(xiàn)，H2O2可誘發(fā)心肌細(xì)胞內(nèi)的鈣超載，引起心肌凋亡。并發(fā)現(xiàn)左卡尼汀可通過抑制Ca2+下游CaN的過表達(dá)抑制心肌細(xì)胞凋亡[5]。

Figure 2. Effect of L-carnitine and CsA on NFATc3 expression in cytoplasmic and nuclear fractions. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs H2O2 group.

CaN是細(xì)胞內(nèi)鈣離子執(zhí)行功能的重要靶蛋白之一。CaN在H2O2誘導(dǎo)的心肌損傷中起著重要作用[5,12]。當(dāng)CaN激活后，其可直接與轉(zhuǎn)錄因子NFATc3結(jié)合，使其發(fā)生去磷酸化，從而使其由胞質(zhì)向胞核轉(zhuǎn)位。介導(dǎo)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)[13]。許多物質(zhì)可通過影響NFATc3的表達(dá)和(或)轉(zhuǎn)位發(fā)揮其生物學(xué)作用[14-15]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)左卡尼汀雖然不能影響NFATc3的表達(dá)，卻可顯著抑制其自胞漿自胞核的轉(zhuǎn)位。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)CaN特異性抑

Figure 3. Effect of L-carnitine and CsA on NFATc3 nuclear translocation in rat cardiac myocytes under H2O2 stimulation (×400).

制劑CsA可顯著抑制H2O2誘發(fā)的NFATc3核轉(zhuǎn)位。提示該現(xiàn)象是CaN依賴的。既然左卡尼汀可抑制CaN的表達(dá)[5]，那么左卡尼汀抑制NFATc3核轉(zhuǎn)位很可能是其抑制CaN表達(dá)的結(jié)果。

綜上所述，左卡尼汀對H2O2誘發(fā)的NFATc3的細(xì)胞核轉(zhuǎn)位呈現(xiàn)明顯的抑制作用。左卡尼汀發(fā)揮其抗氧化應(yīng)激損傷可能與此有關(guān)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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