吳煒景， 李 理， 徐采云， 黃文杰△

(1福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，福建 泉州 362000； 2廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東 廣州 510010)

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPHoxidase，NOX/DUOX)家族是產(chǎn)生ROS的重要來源，是急性肺損傷過程中誘導產(chǎn)生細胞氧化應激的主要參與者。本實驗室的前期研究表明，采用代表性的炎癥因子TNF-α刺激肺泡Ⅱ型上皮細胞來源的A549細胞，可觀察到放大的炎癥反應和過度的氧化應激，造成細胞凋亡水平上升，細胞存活率下降[1-2]。因此，明確NOX/DUOX家族基因的表達機制，是炎癥反應時調(diào)控其衍生的ROS維持在適當水平、減輕內(nèi)源性氧化損傷的基礎。在以高氧誘導的急性肺損傷小鼠模型中，NOX1在肺泡上皮細胞氧化損傷中的作用可能大于NOX2[3]。我們前期的研究提示NF-κB可能參與了TNF-α誘導的肺泡上皮細胞氧化損傷[2, 4]，我們推測其與NOX1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控密切相關。鑒此，本研究采用生物信息學分析技術(shù)，獲取NOX1基因近端啟動子區(qū)NF-κB結(jié)合元件序列，通過構(gòu)建相應的含NOX1啟動子區(qū)及NF-κB結(jié)合元件缺失的啟動子區(qū)螢光素酶重組載體，探討該NF-κB對NOX1基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用。

材 料 和 方 法

1 細胞培養(yǎng)

A549細胞由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學實驗科細胞庫提供，在含10%滅活小牛血清、1×105U/L青霉素和100mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代1次，取處于對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

2 主要試劑

RPMI-1640高糖培養(yǎng)基、胰酶和小牛血清購自HyClone；重組人TNF-α購自PeproTech; Lipofectamine 2000和Opti優(yōu)化培養(yǎng)基購自Invitrogen；PCR試劑購自康為世紀公司；PCR引物由英駿公司合成；核酸marker DL2000、marker DL10000、瓊脂糖、DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒和質(zhì)粒抽提試劑盒購自寶生物公司；pGL3螢光素酶報告基因載體、pRL-TK螢光素酶報告基因載體、雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)、T4 DNA ligase、KpnⅠ和HindⅢ購自Promega；大腸桿菌DH5α 由廣州軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學實驗科提供；胰化蛋白胨、酵母提取物和氨芐青霉素購自Sigma；DNA測序由華大基因研究院完成。

3 主要方法

3.1生物信息學分析 根據(jù)GenBand提供的NOX1基因DNA序列的CDS(GenBank Accession: NG_012567.1/GI:254939587)，確定翻譯起始位點為ATG，將該位點定義為+1，提取其5’上游約1 500 bp的序列。登錄http://www.gene-regulation.com，采用Alibaba 2.1軟件分析上述序列，NOX1近端啟動子區(qū)約1 500 bp范圍內(nèi)可預測到2個NF-κB結(jié)合元件。元件1稱為NOX1/NF-κB1，位于-1 095～-1 086，核心序列為5’-CAGGAAAAC-3’；元件2稱為NOX1/NF-κB2：位于-261～-252，核心序列為5’-TAAAATCCCC-3’，見圖1。我們運用EMSA證實NOX1/NF-κB1不具有與TNF-α探針的結(jié)合活性(結(jié)果未列)，故將翻譯起始位點上游-236至-323的序列作為缺失位點。

Figure 1. Identification of NF-κB responsive cis-acting elements in the proximal promoter of human NOX1 gene.

3.2重組載體構(gòu)建 (1) 采用Primer Premier 5.0軟件設計引物，用于擴增NOX1基因近端啟動子區(qū)全段約1 415 bp，上游和下游引物分別引入KpnⅠ和HindⅢ酶切位點，序列及產(chǎn)物長度見表1，橫線部分為KpnⅠ和HindⅢ酶切位點。(2) 采用上述軟件設計用于擴增NOX1基因近端啟動子區(qū)A段和B段的特異性引物，分別稱為AF、AR和BF、BR。AF和BR端分別引入KpnⅠ和HindⅢ酶切位點，AR和BF含有重疊部分可將A段和B段連接，產(chǎn)物約1 327 bp，較全長片段缺少-236至-323的序列。引物序列及產(chǎn)物長度見表1。(3) PCR擴增NOX1基因近端啟動子區(qū)全段、A段和B段： 按試劑盒說明書提取A549細胞基因組DNA，超微量分光光度計NanoDrop定量。反應體系：2×PCR Pre-Master Buffer 10 μL，F(xiàn)orward Primer 0.5 μL，Reverse Primer 0.5 μL，Template DNA 3.0 μL，dH2O 6.0 μL，total 20.0 μL。反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s,51 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,共40個循環(huán)，72 ℃ 10 min。(4)重疊PCR連接NOX1基因近端啟動子區(qū)A段和B段并擴增A+B段：按試劑盒說明書將上述A段和B段的PCR擴增產(chǎn)物(分別為NOX1-A和NOX1-B)依次行電泳、回收、純化。連接A段和B段的反應體系：2×PCR Pre-Master Buffer 10.0 μL，NOX1-A 1.5 μL，NOX1-B 1.5 μL，dH2O 12.0 μL，total 25.0 μL。反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s,51 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,共5個循環(huán)，72 ℃ 2 min，4 ℃ 10 min。擴增A+B段的反應體系：在上述反應產(chǎn)物中加入2×PCR Pre-Master Buffer 10.0 μL，Primer AF 0.5 μL，Primer BR 0.5 μL，dH2O 14.0 μL，總體系至50.0 μL。反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s,51 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,共35個循環(huán)，72 ℃ 10 min。(5) 含NOX1近端啟動子區(qū)的重組pGL3載體的構(gòu)建：將NOX1基因近端啟動子區(qū)全片段、A+B片段和pGL3空載體進行KpnⅠ和HindⅢ位點的雙酶切、電泳及回收，獲取純化的目的片段和pGL3線性載體，分光光度計定量。以T4 DNA連接酶將目的片段與pGL3線性載體連接，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞，涂板培養(yǎng)，搖菌并抽提質(zhì)粒。將質(zhì)粒進行雙酶切、電泳初步鑒定，同時送華大基因研究院DNA測序、比對。比對正確的質(zhì)粒分別命名為“全長載體pGL3-NOX1-1415”和 “缺失載體pGL3-NOX1-1327”。

表1 引物序列

3.3細胞螢光素酶活性測定 按照下法配制轉(zhuǎn)染液：取pGL3重組質(zhì)粒4.0μg和pRL-TK0.4μg加入到250μL的Opti優(yōu)化培養(yǎng)基，室溫靜置5min；取Lipofectamine2000 10μL加入到250μLOpti優(yōu)化培養(yǎng)基，室溫靜置5min；兩者混勻，室溫靜置20min，用完全培養(yǎng)基稀釋至1mL/well后再次靜置20min即可用于轉(zhuǎn)染實驗。

將細胞分為a組：轉(zhuǎn)染pGL3空質(zhì)粒；b組：轉(zhuǎn)染pGL3-NOX1-1415質(zhì)粒；c組：轉(zhuǎn)染pGL3-NOX1-1327質(zhì)粒；將細胞以2×108/L接種于6孔板，待貼壁細胞的融合度達到50%，傾去培養(yǎng)基，將上述轉(zhuǎn)染液加入細胞培養(yǎng)孔，繼續(xù)培養(yǎng)6h后停止轉(zhuǎn)染，傾去轉(zhuǎn)染液，以PBS輕輕洗滌3次，瞬時轉(zhuǎn)染結(jié)束，繼續(xù)以含TNF-α(10μg/L)的無血清培養(yǎng)基刺激24h，收獲細胞。按試劑盒說明書裂解細胞，Biocell多功能酶標儀先后測定螢火蟲螢光素酶活性(記為A1)和海腎螢光素酶活性(記為A2)，A1/A2即為螢光素酶活性，表示插入啟動子的活性。

4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 13.0軟件包分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，所有數(shù)據(jù)均進行方差齊性檢驗。采用單因素方差分析進行組間均數(shù)比較，滿足方差齊性的多重比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 重組質(zhì)粒pGL3-NOX1-1415和pGL3-NOX1-1327的雙酶切電泳結(jié)果

各片段PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖2所示：a泳道為片段A，約1 100 bp；b泳道為片段B，約250 bp，c泳道為片段A+B，約1 300 bp；d泳道為全長片段，約1 400 bp。缺失片段A+B較全長片段電泳速度快，提示分子量稍小，缺失成功。

Figure 2. Electrophoresis image of different PCR products. Marker: DL2000； a: fragment A; b: fragment B; c: fragment A+B; d: NOX1 promoter.

全長載體pGL3-NOX1-1415雙酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖3所示：a泳道為全長片段；b泳道為空質(zhì)粒pGL3；c泳道為質(zhì)粒pGL3-NOX1-1415；d泳道為雙酶切產(chǎn)物。位于泳道d的2條酶切產(chǎn)物分別與全長片段、空質(zhì)粒pGL3處于同一水平，提示該載體確實由兩者重組而成。

Figure 3. Electrophoresis image of pGL3-NOX1-1415. Marker: DL10000； a: NOX1 promoter; b: pGL3; c: pGL3-NOX1-1415; d: products of double digestion.

缺失載體pGL3-NOX1-1327雙酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖4所示：a泳道為缺失片段A+B；b泳道為空質(zhì)粒pGL3；c泳道為質(zhì)粒pGL3-NOX1-1327；d泳道為雙酶切產(chǎn)物。位于泳道d的2條酶切產(chǎn)物分別與缺失片段A+B、空質(zhì)粒pGL3處于同一水平，提示該載體確實由兩者重組而成。

Figure 4. Electrophoresis image of pGL3-NOX1-1327. Marker: DL10000； a: fragment A+B; b: pGL3; c: pGL3-NOX1-1327; d: products of double digestion.

2 重組質(zhì)粒pGL3-NOX1-1415和pGL3-NOX1-1327的測序結(jié)果的對比

2個重組質(zhì)粒的測序結(jié)果分別經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對，序列正確，載體構(gòu)建成功。圖5所示為核心序列對比，圖5A為缺失載體pGL3-NOX1-1327，圖5B為全長載體pGL3-NOX1-1415，藍線所示為兩者共有序列，紅線所示即為缺失片段，圖5A不含該序列，NF-κB結(jié)合元件缺失成功。

Figure 5. Sequence comparison of pGL3-NOX1-1415 and pGL3-NOX1-1327. A： pGL3-NOX1-1327; B： pGL3-NOX1-1415. The blue underline shows the same sequence of these 2 vectors. The red underline shows the deleted sequence.

3 細胞螢光素酶活性的比較

單因素方差分析結(jié)果顯示，分別轉(zhuǎn)染pGL3空質(zhì)粒、pGL3-NOX1-1415質(zhì)粒和pGL3-NOX1-1327質(zhì)粒后，經(jīng)TNF-α刺激的A549細胞螢光素酶活性的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。轉(zhuǎn)染pGL3-NOX1-1415質(zhì)粒和pGL3-NOX1-1327質(zhì)粒的A549細胞螢光素酶活性較轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的A549細胞增強(85.500±3.619vs20.500±1.643, 61.500±3.782vs20.500±1.643)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染缺失NF-κB結(jié)合元件的pGL3-NOX1-1327質(zhì)粒細胞螢光素酶活性較轉(zhuǎn)染pGL3-NOX1-1415質(zhì)粒明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖6。

Figure 6. The luciferase activity of the cells transfected with different plasmids.A: pGL3 group; B: pGL3-NOX1-1415 group； C: pGL3-NOX1-1327 group. Mean±SD.n=6. *P<0.05 vs A； #P<0.05 vs B.

討 論

炎癥反應及其誘發(fā)的氧化應激是ALI/ARDS重要的發(fā)病機制，針對ALI患者的肺組織保護策略，進行有效抗感染治療的同時對機體免疫系統(tǒng)合理干預，將過度的炎癥反應和氧化應激維持在適當水平，對于保持肺結(jié)構(gòu)細胞完整性同等重要。明確氧化應激相關基因的表達機制，找到其調(diào)控靶點從而調(diào)節(jié)ALI氧化應激損傷，可能比單一補充細胞因子拮抗劑或抗氧化劑效果更好。

NOX1基因是NOX/DUOX家族的重要成員，是調(diào)控ALI時上皮細胞ROS生成的主要基因。本實驗室前期研究中，以TNF-α刺激肺泡II型上皮細胞A549，觀察到細胞上清液中促炎細胞因子IL-1β、IL-6、IL-8及抑炎細胞因子IL-4、IL-10表達水平均上調(diào)，氧化物質(zhì)活性氧、丙二醛生成增加，抗氧化物質(zhì)超氧化物歧化酶、總谷胱甘肽消耗增多，提示炎癥反應放大的同時誘發(fā)過度的氧化應激，且存在細胞凋亡水平上調(diào)的現(xiàn)象[1-2]。上述實驗過程較好地模擬了急性肺損傷發(fā)生時II型上皮細胞的炎癥環(huán)境。在該模型上，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)TNF-α誘導的A549細胞NOX1基因與NF-κBp65基因表達上調(diào)趨勢相同，提示NF-κB可能參與急性肺損傷過程中NOX1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。Lee等[5]指出小鼠巨噬細胞NOX1啟動子區(qū)含有NF-κB結(jié)合位點，NF-κB可能是NOX1表達的關鍵轉(zhuǎn)錄因子，其調(diào)控作用具有細胞特異性。本研究進一步采用常用的生物信息學軟件分析獲得NOX1基因近端啟動子的2個NF-κB結(jié)合元件，該結(jié)果與Manea等[6]預測的位點相似。該團隊采用CHIP、熒光載體構(gòu)建等技術(shù)證實，在TNF-α刺激的動脈平滑肌上皮細胞中，NF-κB與NOX1基因翻譯起始位點上游-258～267區(qū)域結(jié)合，活化NOX1基因的轉(zhuǎn)錄。因此，本實驗將包含該核心位點在內(nèi)的翻譯起始位點上游-236～-323區(qū)域作為缺失目的序列。

報告基因是用于研究啟動子與轉(zhuǎn)錄因子相互作用的常用工具。pGL3質(zhì)粒帶有螢火蟲螢光素酶的編碼區(qū)，但不含啟動子和增強子，將目的啟動子片段插入該質(zhì)粒，活化的轉(zhuǎn)錄因子與該啟動子區(qū)結(jié)合可編碼螢光素酶生成，通過檢測螢光素酶的活性，可間接反應轉(zhuǎn)錄因子對該啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。本研究克隆NOX1近段啟動子區(qū)約1 400 bp并插入該載體，構(gòu)建含NOX1基因啟動子全長片段的質(zhì)粒pGL3-NOX1-1415，轉(zhuǎn)染進入A549細胞后經(jīng)TNF-α刺激24 h，可觀察到其螢光素酶活性較轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒顯著升高，提示TNF-α刺激后NOX1基因表達明顯增強。

NF-κB作為一種具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核因子，廣泛參與免疫、炎癥、氧化應激、細胞增殖、細胞凋亡等生理病理過程，也是急性肺損傷發(fā)生、發(fā)展過程中炎癥-氧化應激環(huán)路中重要的調(diào)控節(jié)點。TNF-α是ALI過程出現(xiàn)的促炎癥細胞因子之一，能促發(fā)“瀑布式炎癥級聯(lián)反應”，活化其它細胞因子的釋放過程[7]。研究表明，TNF-α可以通過與細胞膜上特異性受體TNFR1結(jié)合，激活“RIP1-MEKK3-TAK1-IKK”通路，使胞漿中無活性的NF-κB/I-κB二聚體解離；或者通過與TNFR2結(jié)合，募集可降解I-κB的細胞凋亡抑制因子cIAP-1 和cIAP-2，活化NF-κB的核轉(zhuǎn)位?；罨蟮腘F-κB在細胞核內(nèi)與靶基因的啟動子結(jié)合，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄[8]。NF-κB的靶基因包括NOX2[9]、誘導型一氧化氮合酶[10]、環(huán)氧化酶2[11]、超氧化物歧化酶[12]、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶[13]等促氧化和抗氧化相關基因。本研究預測NOX1為NF-κB的靶基因，并以TNF-α作為獨立因素刺激A549細胞，模擬ALI誘發(fā)的細胞炎癥-氧化損傷，將NF-κB結(jié)合元件的位置明確為翻譯起始位點上游-236至-323的區(qū)域，核心序列位于-261 至 -252，為5’-TAAAATCCCC-3’。我們采用重疊延伸PCR技術(shù)，成功獲得含NOX1近端啟動子區(qū)部分片段缺失的“缺失載體”pGL3-NOX1-1327。同時熒光素酶檢測結(jié)果顯示，載體pGL3-NOX1-1327啟動子區(qū)活性較pGL3-NOX1-1415明顯下調(diào)，這提示-236～323區(qū)域(NF-κB結(jié)合元件所在區(qū)域)含有可被轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合并活化的有效元件；缺少該片段的NOX1基因啟動子活性降低。

綜上，本研究應用載體構(gòu)建技術(shù)和重疊延伸PCR技術(shù)，成功構(gòu)建含NOX1啟動子全長片段的pGL3-NOX1-1415及缺失了該啟動子區(qū)的有活性NF-κB結(jié)合元件的pGL3-NOX1-1327，為后續(xù)NOX1基因啟動子區(qū)的研究奠定了分子生物學基礎。缺失NF-κB元件的NOX1基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性下調(diào)，提示在TNF-α誘導肺泡上皮細胞炎癥反應繼發(fā)的氧化應激損傷中，NF-κB參與了NOX1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，其具體的結(jié)合位點及活性有待后續(xù)的實驗中運用EMSA、ChIP等技術(shù)，從蛋白-DNA結(jié)合的角度進一步驗證。探討NF-κB對NOX1的調(diào)控機制有助于我們了解急性肺損傷發(fā)生時以TNF-α為代表的炎癥因子誘發(fā)的結(jié)構(gòu)細胞氧化應激損傷機制，為急性肺損傷在基因?qū)用娴脑\治研究奠定基礎。

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