惠++陽②++陳光英++宋小平++陳文豪

熱帶藥用植物化學(xué)教育部重點實驗室 海南海口 571127）

摘 要 采用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）法，以2種人腫瘤細胞株（SGC-7901、SPCA-1）為研究對象，對海南地區(qū)核果木屬植物密花核果木的抗腫瘤有效部位進行篩選研究。采用硅膠柱色譜分離技術(shù)對石油醚、氯仿萃取部位進行進一步的分離，獲得不同極性組分?？鼓[瘤活性試驗結(jié)果表明，石油醚、氯仿萃取部位及其不同極性組分顯示不同程度的腫瘤細胞增殖抑制活性，是其抗腫瘤有效部位。

關(guān)鍵詞 核果木屬 ；密花核果木 ；抗腫瘤活性 ；SGC-7901 ；SPCA-1

分類號 R284.1

全世界大戟科（Euphorbiaceae）核果木屬（Drypetes）植物約200種，主要分布在亞洲、美洲和非洲中西部等熱帶、亞熱帶地區(qū)。在非洲民間，該屬植物為傳統(tǒng)藥材，主要用于治療淋病、惡性腫瘤、黑熱病、類風(fēng)濕、支氣管炎等癥[1-2]，藥用史由來已久。中國核果木屬植物產(chǎn)13種，2變種，分布于臺灣、廣東、海南、廣西、貴州和云南等省區(qū)[3]。近10年來，國內(nèi)外學(xué)者對該屬植物進行了廣泛的化學(xué)成分研究，從中分離得到倍半萜內(nèi)酯[4-6]、羅漢松烷型二萜[7-8]、齊墩果烷和木栓烷型三萜[9-11]、查爾酮[12]和一些多酚類化合物[13]，同時還進行了諸如抗炎鎮(zhèn)痛、抗病原蟲、抗真菌和α-葡萄糖苷酶抑制活性等藥理活性研究[4-6，9-11，13]，但針對該屬植物進行抗腫瘤活性方面的研究還未見報道。

密花核果木（Drypetes congestiflora Chun & T. Chen）分布于海南、廣東、云南等省的山地疏林中，是一新擬種，為海南主要經(jīng)濟林木[3]，以Drypetes congestiflora為關(guān)鍵詞，在SciFinder數(shù)據(jù)庫搜索發(fā)現(xiàn)，目前未見國內(nèi)外對其化學(xué)成分和藥理活性的相關(guān)研究報道。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，其乙醇提取物對人肺癌細胞（SPCA-1）、人胃癌細胞（SGC-7901）及人白血病細胞（K-562）具有較強的腫瘤細胞毒活性。筆者對密花核果木的乙醇提取物的不同溶劑萃取物進行進一步抗腫瘤活性篩選，以期為跟蹤分離具有較好抗腫瘤活性的單體化合物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

密花核果木的莖于2011年7月采自海南省昌江市。經(jīng)海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院鐘瓊芯教授鑒定為大戟科（Euphorbiaceae）核果木屬（Drypetes）密花核果木（Drypetes congestilora Chun & T. Chen）。

1.1.2 儀器與試劑

高壓滅菌鍋（森展企業(yè)有限公司）；倒置顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠）；Elx800型酶標儀（美國BioTek公司）；MCO-15AC型CO2恒溫培養(yǎng)箱（SANYO公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠）。RPMI-1640培養(yǎng)液（Gibco公司）；胰酶（Gibco公司）；MTT（Sigma公司）；優(yōu)級新生牛血清（蘭州民海生物工程有限公司）；硅膠柱層析填料（青島海洋化工廠分廠，200-300目）。石油醚（60～90℃）、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇（西隴化工股份有限公司）。

1.1.3 細胞株

人肺腺癌細胞株SPCA-1（南方醫(yī)科大學(xué)）；人胃癌細胞株SGC-7901（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院）。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備

采密花核果木莖20 kg用95%乙醇室溫浸泡3次，5 d/次，合并提取液，減壓濃縮得粘稠狀棕色浸膏1.0 kg，將其加水懸浮分散，分別用石油醚（60～90℃），氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得相應(yīng)萃取部位：石油醚（80 g），氯仿（120 g），乙酸乙酯（15 g）和正丁醇（450 g）。

稱取石油醚部位75 g，采用80 g（200～300目，下同）柱層析硅膠拌樣，800 g硅膠濕法裝柱，采用石油醚～乙酸乙酯（30∶1～3∶2）梯度洗脫，TLC檢測合并相同流份，減壓濃縮得A1 （石油醚∶乙酸乙酯=30∶1），A2（20∶1），A3（15∶1），A4（10：1），A5（8∶1），A6（5∶1），A7（3∶1）， A8（2∶1），A9（3∶2）；氯仿萃取部位（115 g）加硅膠（110 g）拌樣，揮干。硅膠1.0 kg濕法裝柱，氯仿～乙酸乙酯（25∶1～0∶1）梯度洗脫。TLC檢測合并相同流份，減壓濃縮得B1 （氯仿∶乙酸乙酯=25∶1），B2 （15∶1），B3 （9∶1），B4（6∶1），B5（4∶1），B6 （3∶1），B7（2∶1），B8（0∶1）。以上4種不同溶劑萃取部位和石油醚、氯仿萃取部位各個極性組分均用于抗腫瘤活性篩選。

1.2.2 體外腫瘤細胞增殖抑制活性實驗

腫瘤細胞株培養(yǎng)：用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞增殖抑制試驗（MTT法[14]）：取對數(shù)生長期的腫瘤細胞株，用0.25%的胰蛋白酶消化，10% 新生小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)制成5×104個/mL 的細胞懸液，接種于96孔板中，每孔接種180 μL。在37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)8～10 h，待其貼壁，每個孔加入用PBS配制的樣品液，使得樣品終濃度分別為1、10和100 μg/mL。每個濃度平行3孔，繼續(xù)培養(yǎng)44 h后，每孔加入50 μL MTT （1 mg/mL，PBS配制），在37℃、5% CO2條件下繼續(xù)溫育4 h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO，在微型振蕩器上搖勻15 min，結(jié)晶溶解后，在酶聯(lián)免疫檢測儀上選擇570 nm，測定各孔的吸光值，同時設(shè)置空白組（僅加入含細胞的培養(yǎng)液）和對照組（以培養(yǎng)液替代藥物），計算細胞增殖抑制率。抑制率（%）=（1-實驗組3孔OD值平均值/對照組3孔OD值平均值）×100%。endprint

IC50值的測定：根據(jù)MTT實驗初步篩選結(jié)果，選擇濃度為100 μg/mL時抑制率>50%的樣品，進一步測定其半數(shù)抑制濃度IC50。以同一樣品濃度對數(shù)值為橫坐標，以抑制率作縱坐標，作回歸曲線，計算出樣品IC50值。采用SPSS 13.0進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑萃取部位對腫瘤細胞增殖抑制作用

采用MTT法對密花核果木莖乙醇提取物的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取部位進行抗腫瘤試驗。若樣品濃度為100 μg/mL時，對腫瘤細胞增殖抑制率>50%再進行IC50值測定。結(jié)果如表1所示，石油醚部位對所選腫瘤細胞株SPCA-1、SGC-7901均顯示不同程度的增殖抑制活性，IC50值分別為100.20，70.27 μg/mL；氯仿萃取部位對SGC-7901細胞顯示微弱抑制增殖活性，IC50值為130.41 μg/mL。

2.2 石油醚、氯仿部位不同極性組分對腫瘤細胞增殖抑制作用

采用MTT法對密花核果木莖乙醇提取物的石油醚部位（A1～A9）、氯仿部位（B1～B8）不同極性組在濃度為100 μg/mL時，對SPCA-1、SGC-7901腫瘤細胞增殖抑制率試驗。結(jié)果如表2所示，石油醚萃取部位的不同極性組分表現(xiàn)出較為廣泛的增殖抑制活性，抑制率從30.67%～85.61%，且A6-A9這5個組分均具有相當?shù)哪[瘤細胞毒活性。進一步TLC檢測發(fā)現(xiàn)，在254 nm紫外燈照射下均無明顯斑點，而采用硫酸乙醇（5% V/V）顯色劑顯色發(fā)現(xiàn)，它們主要為三萜或者是甾醇類的特征紫色或紫紅色斑點；而氯仿萃取部位的不同極性組分也表現(xiàn)出較萃取部位更好的抗腫瘤活性，其中B1、B5-B7的活性較好，抑制率從56.78%～74.69%。TLC檢測發(fā)現(xiàn)其與石油醚部位的成分存在明顯差異，特別是254 nm紫外燈照射下顯示有明顯斑點，綜合文獻所述，核果木屬植物化合物的結(jié)構(gòu)特點可能存在羅漢松烷型二萜或倍半萜內(nèi)酯等具有共軛體系的化合物，這對于后期活性成分分離需要重點關(guān)注。

3 討論

核果木屬植物作為非洲民間治療惡性腫瘤的傳統(tǒng)藥材，但目前國內(nèi)外針對該屬植物主要側(cè)重于抗炎鎮(zhèn)痛、抗病原蟲、抗真菌等活性研究，尚未開展抗腫瘤活性方面的研究工作。密花核果木作為海南地區(qū)主要經(jīng)濟林木，資源豐富，但目前尚未見有關(guān)其化學(xué)成分及藥理活性的報道。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，密花核果木莖乙醇提取物的石油醚、氯仿萃取部位的不同極性組分顯示出廣泛的腫瘤細胞增殖抑制活性。為密花核果木植物資源的綜合利用及抗腫瘤藥開發(fā)提供理論依據(jù)。

參考文獻

[1] Dalziel M J. The useful plants of west tropical africal[M]. London： The Crown Agents for the Colonies 1937， 140-141.

[2] Irvine F R. Woody plants of Ghana [M]. London： Oxford University Press， 1961， 223-226.

[3] 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會，中國植物志[M]，北京：科學(xué)出版社，1994， 44：39-51.

[4] Chungag-Anye N B， Njamen D， Dongmo A B， et al. Anti-inflammatory and analgesic properties of the stem extract of Drypetes molunduana Pax and Hoffm. （Euphorbiaceae）in rats[J]. Pharmaceutical and Pharmacological Letters， 2001， 11（2）： 61-63.

[5] Chungag-Anye N B， Njamen D， Dongmo A B， et al. Anti-inflammatory and analgesic effects of Drypemolundein A， a sesquiterpene lactone from Drypetes molunduana[J]. Pharmaceutical Biology， 2002， 41（1）： 26-30.

[6] Wansi J D， Wandji J， Lallemand M C， et al. Antileishmanial furansesquiterpene and triterpenoids from Drypetes chevalieri Beille （Euphorbiaceae）[J]. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat， 2007， 6（1）： 5-10.

[7] Ngouela S， Ngoupayo J， Noungoue D T， et al. Gossweilone： a new podocarpane derivative from the stem bark of Drypetes gossweileri （Euphorbiaceae） [J]. Bulletin of the Chemical Society of Ethiopia， 2003， 17（2）： 181-184.

（下轉(zhuǎn)第68頁）endprint

IC50值的測定：根據(jù)MTT實驗初步篩選結(jié)果，選擇濃度為100 μg/mL時抑制率>50%的樣品，進一步測定其半數(shù)抑制濃度IC50。以同一樣品濃度對數(shù)值為橫坐標，以抑制率作縱坐標，作回歸曲線，計算出樣品IC50值。采用SPSS 13.0進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑萃取部位對腫瘤細胞增殖抑制作用

采用MTT法對密花核果木莖乙醇提取物的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取部位進行抗腫瘤試驗。若樣品濃度為100 μg/mL時，對腫瘤細胞增殖抑制率>50%再進行IC50值測定。結(jié)果如表1所示，石油醚部位對所選腫瘤細胞株SPCA-1、SGC-7901均顯示不同程度的增殖抑制活性，IC50值分別為100.20，70.27 μg/mL；氯仿萃取部位對SGC-7901細胞顯示微弱抑制增殖活性，IC50值為130.41 μg/mL。

2.2 石油醚、氯仿部位不同極性組分對腫瘤細胞增殖抑制作用

采用MTT法對密花核果木莖乙醇提取物的石油醚部位（A1～A9）、氯仿部位（B1～B8）不同極性組在濃度為100 μg/mL時，對SPCA-1、SGC-7901腫瘤細胞增殖抑制率試驗。結(jié)果如表2所示，石油醚萃取部位的不同極性組分表現(xiàn)出較為廣泛的增殖抑制活性，抑制率從30.67%～85.61%，且A6-A9這5個組分均具有相當?shù)哪[瘤細胞毒活性。進一步TLC檢測發(fā)現(xiàn)，在254 nm紫外燈照射下均無明顯斑點，而采用硫酸乙醇（5% V/V）顯色劑顯色發(fā)現(xiàn)，它們主要為三萜或者是甾醇類的特征紫色或紫紅色斑點；而氯仿萃取部位的不同極性組分也表現(xiàn)出較萃取部位更好的抗腫瘤活性，其中B1、B5-B7的活性較好，抑制率從56.78%～74.69%。TLC檢測發(fā)現(xiàn)其與石油醚部位的成分存在明顯差異，特別是254 nm紫外燈照射下顯示有明顯斑點，綜合文獻所述，核果木屬植物化合物的結(jié)構(gòu)特點可能存在羅漢松烷型二萜或倍半萜內(nèi)酯等具有共軛體系的化合物，這對于后期活性成分分離需要重點關(guān)注。

3 討論

核果木屬植物作為非洲民間治療惡性腫瘤的傳統(tǒng)藥材，但目前國內(nèi)外針對該屬植物主要側(cè)重于抗炎鎮(zhèn)痛、抗病原蟲、抗真菌等活性研究，尚未開展抗腫瘤活性方面的研究工作。密花核果木作為海南地區(qū)主要經(jīng)濟林木，資源豐富，但目前尚未見有關(guān)其化學(xué)成分及藥理活性的報道。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，密花核果木莖乙醇提取物的石油醚、氯仿萃取部位的不同極性組分顯示出廣泛的腫瘤細胞增殖抑制活性。為密花核果木植物資源的綜合利用及抗腫瘤藥開發(fā)提供理論依據(jù)。

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[5] Chungag-Anye N B， Njamen D， Dongmo A B， et al. Anti-inflammatory and analgesic effects of Drypemolundein A， a sesquiterpene lactone from Drypetes molunduana[J]. Pharmaceutical Biology， 2002， 41（1）： 26-30.

[6] Wansi J D， Wandji J， Lallemand M C， et al. Antileishmanial furansesquiterpene and triterpenoids from Drypetes chevalieri Beille （Euphorbiaceae）[J]. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat， 2007， 6（1）： 5-10.

[7] Ngouela S， Ngoupayo J， Noungoue D T， et al. Gossweilone： a new podocarpane derivative from the stem bark of Drypetes gossweileri （Euphorbiaceae） [J]. Bulletin of the Chemical Society of Ethiopia， 2003， 17（2）： 181-184.

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IC50值的測定：根據(jù)MTT實驗初步篩選結(jié)果，選擇濃度為100 μg/mL時抑制率>50%的樣品，進一步測定其半數(shù)抑制濃度IC50。以同一樣品濃度對數(shù)值為橫坐標，以抑制率作縱坐標，作回歸曲線，計算出樣品IC50值。采用SPSS 13.0進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑萃取部位對腫瘤細胞增殖抑制作用

采用MTT法對密花核果木莖乙醇提取物的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取部位進行抗腫瘤試驗。若樣品濃度為100 μg/mL時，對腫瘤細胞增殖抑制率>50%再進行IC50值測定。結(jié)果如表1所示，石油醚部位對所選腫瘤細胞株SPCA-1、SGC-7901均顯示不同程度的增殖抑制活性，IC50值分別為100.20，70.27 μg/mL；氯仿萃取部位對SGC-7901細胞顯示微弱抑制增殖活性，IC50值為130.41 μg/mL。

2.2 石油醚、氯仿部位不同極性組分對腫瘤細胞增殖抑制作用

采用MTT法對密花核果木莖乙醇提取物的石油醚部位（A1～A9）、氯仿部位（B1～B8）不同極性組在濃度為100 μg/mL時，對SPCA-1、SGC-7901腫瘤細胞增殖抑制率試驗。結(jié)果如表2所示，石油醚萃取部位的不同極性組分表現(xiàn)出較為廣泛的增殖抑制活性，抑制率從30.67%～85.61%，且A6-A9這5個組分均具有相當?shù)哪[瘤細胞毒活性。進一步TLC檢測發(fā)現(xiàn)，在254 nm紫外燈照射下均無明顯斑點，而采用硫酸乙醇（5% V/V）顯色劑顯色發(fā)現(xiàn)，它們主要為三萜或者是甾醇類的特征紫色或紫紅色斑點；而氯仿萃取部位的不同極性組分也表現(xiàn)出較萃取部位更好的抗腫瘤活性，其中B1、B5-B7的活性較好，抑制率從56.78%～74.69%。TLC檢測發(fā)現(xiàn)其與石油醚部位的成分存在明顯差異，特別是254 nm紫外燈照射下顯示有明顯斑點，綜合文獻所述，核果木屬植物化合物的結(jié)構(gòu)特點可能存在羅漢松烷型二萜或倍半萜內(nèi)酯等具有共軛體系的化合物，這對于后期活性成分分離需要重點關(guān)注。

3 討論

核果木屬植物作為非洲民間治療惡性腫瘤的傳統(tǒng)藥材，但目前國內(nèi)外針對該屬植物主要側(cè)重于抗炎鎮(zhèn)痛、抗病原蟲、抗真菌等活性研究，尚未開展抗腫瘤活性方面的研究工作。密花核果木作為海南地區(qū)主要經(jīng)濟林木，資源豐富，但目前尚未見有關(guān)其化學(xué)成分及藥理活性的報道。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，密花核果木莖乙醇提取物的石油醚、氯仿萃取部位的不同極性組分顯示出廣泛的腫瘤細胞增殖抑制活性。為密花核果木植物資源的綜合利用及抗腫瘤藥開發(fā)提供理論依據(jù)。

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[5] Chungag-Anye N B， Njamen D， Dongmo A B， et al. Anti-inflammatory and analgesic effects of Drypemolundein A， a sesquiterpene lactone from Drypetes molunduana[J]. Pharmaceutical Biology， 2002， 41（1）： 26-30.

[6] Wansi J D， Wandji J， Lallemand M C， et al. Antileishmanial furansesquiterpene and triterpenoids from Drypetes chevalieri Beille （Euphorbiaceae）[J]. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat， 2007， 6（1）： 5-10.

[7] Ngouela S， Ngoupayo J， Noungoue D T， et al. Gossweilone： a new podocarpane derivative from the stem bark of Drypetes gossweileri （Euphorbiaceae） [J]. Bulletin of the Chemical Society of Ethiopia， 2003， 17（2）： 181-184.

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