董晶晶+薛春雨+習丙文+等

摘要：在神經(jīng)內(nèi)分泌下丘腦-垂體-腎間組織軸調(diào)控中，黑素皮質(zhì)素受體2（MC2R）與垂體釋放的促腎上腺皮質(zhì)激素結(jié)合而激活相應的cAMP信號轉(zhuǎn)導途徑，對魚類的應激反應調(diào)控具有重要的作用。本研究通過PCR、RACE技術(shù)克隆獲得團頭魴MC2R mRNA序列，并通過實時定量PCR分析了團頭魴MC2R組織分布情況及捕撈脅迫后的表達變化。結(jié)果顯示，獲得的MC2R mRNA序列開放閱讀框為915 bp，編碼304個氨基酸。序列同源性及系統(tǒng)育分析顯示，團頭魴MC2R氨基酸序列與鯉科魚類的MC2R聚為一支，與金魚（Carassius auratus）MC2R的氨基酸序列同源性最高（87%）。組織分布結(jié)果表明，頭腎中MC2R的表達量最高，脾臟、精巢和腦中有相對較高的表達量，中腎、肝、腸和肌肉等MC2R的表達量相對較低。經(jīng)捕撈出水體60 s的急性應激處理后，皮質(zhì)醇在4 h時顯著升高，24 h時表現(xiàn)出下降的趨勢；MC2R基因表達量在頭腎中變化不顯著，然而脾、腦和精巢中MC2R 在4 h時表達量相對于1 h則呈現(xiàn)出顯著的下降。通過對團頭魴應激后主要調(diào)控因子變化規(guī)律的研究，可為魚類應激后調(diào)控措施的實施提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：團頭魴；MC2R基因；皮質(zhì)醇；克??；組織表達；應激

中圖分類號： S917文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0020-07

收稿日期：2014-03-11

基金項目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金（編號：CARS-46-10）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金（編號：2013JBFM10）。

作者簡介：董晶晶（1989—），女，河南周口人，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)動物營養(yǎng)與疾病防控的研究。E-mail：jingzsmx@163.com。

通信作者：謝駿，研究員，主要從事池塘微生態(tài)學、水產(chǎn)動物的應激機制、細菌性病害生態(tài)防控技術(shù)的研究。E-mail：xiej@ffrc.cn。團頭魴（Megalobrama amblycephala），又稱武昌魚，隸屬于鯉形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprinidae）鳊亞科（Abramidinae）魴屬（Megalobrama），是中國主要的淡水養(yǎng)殖品種之一。但團頭魴魚體應激反應強，抗應激能力低下，在拉網(wǎng)賣魚以及運輸過程中魚體由于應激經(jīng)常出現(xiàn)“發(fā)毛發(fā)紅”，體表黏液減少或無黏液等現(xiàn)象，有時甚至導致魚體死亡，嚴重影響?zhàn)B殖經(jīng)濟效益。魚類應激反應與其他脊椎動物類似，受下丘腦-垂體-腎間組織軸（HPI）的調(diào)控，在應激源刺激后，下丘腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)釋放促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（corticotrophin-releasing hormone，CRH）作用于有促皮質(zhì)激素細胞分布的垂體前外側(cè)部，由促皮質(zhì)激素細胞中的阿片-促黑素細胞皮質(zhì)素原（proopiomelanocortin，POMC）前體肽經(jīng)加工處理生成促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH），進而調(diào)控魚類重要皮質(zhì)激素——皮質(zhì)醇的合成，皮質(zhì)醇釋放到血液中，調(diào)節(jié)呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、能量代謝系統(tǒng)等相應組織器官中的反應變化[1-3]。

黑素皮質(zhì)素受體2（melanocortin 2 receptor，MC2R）是一種具有7個跨膜α螺旋結(jié)構(gòu)的G蛋白偶聯(lián)受體，在ACTH刺激皮質(zhì)醇合成分泌的過程中，MC2R與ACTH特異性結(jié)合，使得相應的cAMP信號轉(zhuǎn)導途徑激活，對脊椎動物皮質(zhì)醇合成和釋放的調(diào)控具有重要意義。MC2R在鼠的腎上腺發(fā)育以及類固醇合成中發(fā)揮著不可替代的作用，鼠MC2R的失活突變，使得高濃度ACTH也不能刺激皮質(zhì)醇的合成，甚至對ACTH刺激不能產(chǎn)生應答反應[4]。

目前MC2R的激活及其配體結(jié)合能力在包括魚類等多種脊椎動物中得到了廣泛的研究[5-8]。研究發(fā)現(xiàn)，MC2R是5種黑素皮質(zhì)素受體（MC1R、MC2R、MC3R、MC4R和MC5R）中最特殊的，主要表現(xiàn)為：（1）其細胞膜表達以及功能的激活均需要黑素皮質(zhì)素受體2輔助蛋白1型（MRAP1）的協(xié)助；（2）MC2R只特異性地與ACTH結(jié)合而被激活，不能結(jié)合黑素細胞刺激素（MSH）等多肽（α-，β-，γ-and δ-MSH）。

MC2R在魚類應激中的作用研究相對較少，對于應激源刺激下MC2R的表達變化，以及ACTH或MSH相關(guān)肽類的刺激對皮質(zhì)醇合成釋放的影響雖已有部分研究[9-11]，但有機體在應激源刺激后的恢復階段，機體調(diào)控使得MC2R表達以及皮質(zhì)醇水平產(chǎn)生的變化還未見報道。由于魚類在生長過程中不可避免會受到一定程度的刺激，了解應激后恢復階段魚體主要應激調(diào)控因子的變化狀況，對于幫助魚體快速恢復正常狀態(tài)、避免不必要的二次損傷具有重要意義。因此，本研究通過反轉(zhuǎn)錄PCR、RACE擴增技術(shù)等獲得團頭魴MC2R mRNA序列，分析了團頭魴MC2R的組織分布特點，并通過捕撈出水體60 s對團頭魴進行急性應激處理，探究團頭魴MC2R的組織表達以及血清皮質(zhì)醇水平的變化，以期為團頭魴等魚類應激后調(diào)控措施的實施提供一定的參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

以團頭魴為試驗對象，所用團頭魴均由中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心南泉基地提供，魚體健康，體表無傷痕，形態(tài)正常、無畸形，游動能力強。

1.2試驗設(shè)計

組織分布試驗所用組織分別取自12條團頭魴，雌、雄各6條，體重（55.9±2.4） g，體長（15.4±0.1） cm，取表皮、肌肉、腸、脾、肝、中腎、頭腎、鰓、心臟、腦、眼、精巢和卵巢等13種組織。采樣前均采用終濃度為150 mg/L的MS-222在缸中對魚體直接進行深度麻醉，快速解剖采取相應組織。

捕撈脅迫試驗共取64條魚，體質(zhì)量（57.4±1.6） g，體長（15.3±0.2） cm，共分為4個組，每組2個缸，每缸8條魚，于玻璃缸中適應2周后進行試驗，處理條件為將魚迅速捕撈至網(wǎng)內(nèi)，并撈出水面60 s后放回水中，分別在脅迫前（設(shè)為 0 h）及捕撈脅迫后靜置（恢復階段）1、4、24 h采樣，采樣前采用終濃度為150 mg/L的MS-222在缸中對魚體直接進行深度麻醉，快速尾靜脈采血，并依據(jù)組織分布試驗結(jié)果，采取MC2R主要表達組織頭腎、脾、腦和精巢。

1.3血清制備及血清皮質(zhì)醇的測定

采集到的血液立即10 000 r/min 4 ℃ 離心5 min，收集血清于-20 ℃保存?zhèn)溆?。血清皮質(zhì)醇的測定采用化學發(fā)光免疫競爭法，在MAGLUMI 1000全自動化學發(fā)光免疫分析儀上進行檢測，試劑盒購自深圳新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學工程有限公司。

1.4組織樣品的準備與總RNA提取

組織各0.05 ～ 0.1 g，用生理鹽水沖洗后加入1 mL RNAiso Plus（TaKaRa，Japan），立即用高通量組織破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）充分勻漿后使用，或凍存于 -80 ℃ 冰箱中備用。RNA的提取按照試劑的操作說明進行，采用分光光度法和1%瓊脂糖凝膠檢測RNA條帶質(zhì)量，取D260 nm/D280 nm值在1.8～2.0之間的樣品。cDNA第一鏈反轉(zhuǎn)錄合成采用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，Japan），并按照使用說明處理RNA去除基因組DNA，以40 mg/L RNA的終濃度逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，獲得的cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5團頭魴MC2R mRNA的克隆

1.5.1引物設(shè)計與合成團頭魴MC2R mRNA全長克隆及實時熒光定量PCR所用引物均列于表1。內(nèi)參基因β-actin引物序列參照Ming等[12]，RPⅡ引物序列參照Zhao等[13]，其他引物設(shè)計采用Primer 5.0，所有引物的合成及序列測定均由上海生工生物工程技術(shù)服務公司完成。表1團頭魴MC2R mRNA克隆以及實時定量PCR所用引物

引物序列（5′-3′）用途P1F：GTACTGSTTYATCTGYARCCTGG；R：AASAGHGANCGGTARCAYTCRCA擴增MC2R保守中間片段P21：GGCTATGGCGAGAATG；2：AAAAGGGCCACGGGAGTTCAG；3：GACGTCTTCTAATGCCTTGGARACE擴增MC2R 5′端P31：TCACAGCTCTGCTCCTGATCCTCTTGC；2-1：ACGATGGACTCCAGTCCGGCC；Tail-PCR擴增MC2R 3′端2-2：TTGATTGGAGTGTTTGTGGCCTGCTGG；2-3：CCTGCTGGGCTCCTTTCTTATTTCATCTMC2RF：ATGACAATGCGTCGTGTAGTGG；R：ATCCTGTTGGCGTGGTGGCReal-Time PCR擴增MC2Rβ-actinF：TCGTCCACCGCAAATGCTTCTA；R：CCGTCACCTTCACCGTTCCAGTReal-Time PCR擴增β-actinRPⅡF：CGCGAGTCATTCCTGTAACATC；R：TGACCCTTCCTCAGCTTTACCAReal-Time PCR擴增RPⅡ注：簡并引物代碼S=G/C；Y=C/T；R=A/G；H=A/T/C；N=A/T/G/C。

1.5.2保守中間片段的擴增通過同源序列比對設(shè)計兼并引物P1-R和P1-F（表1），以總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，分別PCR擴增獲得MC2R的保守中間片段，產(chǎn)物經(jīng)純化、連接載體、轉(zhuǎn)化后測序。

1.5.3MC2R 3′和5′端的擴增根據(jù)所獲得的部分中間片段，分別設(shè)計引物（表1）擴增3′和5′端序列。MC2R的5′端序列采用Invitrogen公司的5′ RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Version 2.0試劑盒獲得；3′端序列采用Tail PCR 的方法從基因組中獲得。產(chǎn)物均經(jīng)過純化并測序，序列拼接后，擴增ORF全長并連接到pMD-18T載體測序進行驗證。

1.6生物信息學分析

團頭魴MC2R氨基酸序列與其他物種MC2R氨基酸序列的相似性分析以及序列比對均使用ClaustalW 2.0（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）進行在線分析。通過Netphos K 1.0預測團頭魴MC2R的蛋白激酶磷酸化位點（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhosK/），通過Netphos K 2.0預測團頭魴MC2R的絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸磷酸化位點（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）。在MEGA 4.1中采用Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，1 000次自舉（Bootstrap）分析計算各節(jié)點支持率。根據(jù)牛視紫紅質(zhì)（BtaRHO）晶體結(jié)構(gòu)模型[14-15]進行MC2R跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembrane domain，TM）的預測。

1.7質(zhì)粒DNA及標準曲線的構(gòu)建

含目的基因片段的質(zhì)粒載體制備如下：以cDNA為模板，用熒光定量PCR引物擴增獲得目的片段；PCR程序條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化之后連接到pMD-18T載體并轉(zhuǎn)化到DH5α中構(gòu)建標曲質(zhì)粒DNA。標曲采用10倍連續(xù)梯度稀釋的5個點進行構(gòu)建，選取的初始稀釋組的濃度設(shè)為100 000，模板濃度以lg值為橫坐標，循環(huán)數(shù)CT值為縱坐標，每個梯度點設(shè)置3個重復，在Microsoft Excel 2007中繪制并計算每個基因擴增的標準曲線方程。

1.8雙內(nèi)參實時定量PCR

根據(jù)獲得的團頭魴MC2R mRNA序列設(shè)計熒光定量特異性引物，雙內(nèi)參基因（RPⅡ和β-actin）及MC2R引物序列在表1中列出。MC2R在團頭魴組織中的表達分布情況，采用SYBG Primix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）Kit（TaKaRa，Japan）按操作說明在ABI 7500 Real Time PCR System上進行。定量PCR體系為20 μL：2 μL cDNA模板、10 μL SYBR green mix、0.4 μL ROX、6.8 μL H2O、引物各0.4 μL。反應程序設(shè)置為：第一階段（50 ℃ 2 min，95 ℃ 3 min），第二階段（95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40次循環(huán)），第三階段溶解曲線分析（95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s）。每個待測樣本同時進行目的基因MC2R以及內(nèi)參基因RPⅡ和β-actin的擴增，每次運行定量PCR都分析溶解曲線以確定無非特異性擴增，陰性對照為2 μL滅菌雙蒸水，為保證混合均勻、減少加樣誤差，每個樣品均設(shè)置3次重復。

1.9數(shù)據(jù)處理

雙內(nèi)參熒光定量結(jié)果處理方法參照Vandesompele等[16]，采用2個內(nèi)參基因幾何平均值進行標準化，并采用雙標準曲線法分析MC2R的表達量。得到的數(shù)據(jù)在SPSS 18.0軟件中采用One-way ANOVA分析團頭魴MC2R在不同組織中的表達分布、捕撈脅迫后組織的表達變化以及血清皮質(zhì)醇水平的變化，顯著性檢驗水平設(shè)置為P<0.05。

2結(jié)果與分析

2.1團頭魴MC2R mRNA序列

通過簡并引物擴增獲得618 bp的MC2R基因中間片段，與其他物種MC2R具有很高的同源性；通過5′ RACE-PCR和3′ Tail-PCR擴增，分別獲得長度為491 bp和1617 bp的擴增片段，序列拼接獲得全長2 495 bp的片段，含有1個 915 bp 的開放閱讀框，編碼304個氨基酸（圖1，MC2R基因登錄號為KF962964），預測分子量大小為33.90 ku，pH值為7.0時的理論等電點為8.35；氨基酸組成中，強堿性氨基酸（K、R）21個，強酸性氨基酸（D、E）16個，疏水氨基酸（A、I、L、F、W、V）152個，極性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y）70個。

2.2團頭魴MC2R的分子特征

ClaustalW分析發(fā)現(xiàn)，獲得的團頭魴MC2R基因編碼的氨基酸序列與已報道的其他脊椎動物MC2R序列具有較高的同源性。其中團頭魴MC2R與斑馬魚（Danio rerio）MC2R、鯉（Cyprinus carpio）MC2R、金魚MC2R氨基酸序列的同源性分別高達85%、83%和87%，與人（Homo sapiens）、牛（Bos taurus）、鼠（Mus musculus）、雞（Gallus gallus）等MC2R氨基酸序列的同源性僅50%左右（表2）。與其他魚類、四肢類的全長氨基酸序列進一步的系統(tǒng)進化分析結(jié)果（圖2）表明，硬骨魚類MC2R聚為一大支，團頭魴MC2R與鯉科魚類聚為一支，并與鯉MC2R的進化距離最近。

與其他MCRs相類似，都具有短的EL和IL，使得MCRs成為最小的G蛋白偶聯(lián)受體，對團頭魴MC2R與其他魚類、四肢類MC2R不同結(jié)構(gòu)區(qū)域的同源性分析發(fā)現(xiàn)，它們的不同結(jié)構(gòu)區(qū)域同源性具有不均衡分布的特征。由圖3序列比對統(tǒng)計的同源性比例表明，團頭魴MC2R與其他魚類及四肢類MC2R在TM2、TM3、TM6和TM7區(qū)的平均同源性分別為

表2團頭魴MC2R與其他來源物種氨基酸序列同源性比較

簡稱種名基因

登錄號與團頭魴

同源性

（%）MamMC2R團頭魴KF962964100.00HamMC2R人（Homo sapiens）NP_00052050.34BtaMC2R牛（Bos taurus）XP_00589241748.28MmuMC2R鼠（Mus musculus）NP_00125864550.17GgaMC2R雞（Gallus gallus）NP_00102668648.68DlaMC2R狼鱸（Dicentrarchus labrax）CCA9511060.27VmoMC2R條斑星鰈（Verasper moseri）BAI6659557.91TruMC2R紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）NP_00102793656.61OmyMC2R虹鱒（Oncorhynchus mykiss）NP_00111815262.46DreMC2R斑馬魚（Danio rerio）NP_85130284.87CauMC2R金魚（Carassius auratus）BAJ8347283.44CcaMC2R鯉（Cyprinus carpio）CAE5384586.51CmiMC2R米氏葉吻銀鮫（Callorhinchus milii）FAA0070443.43

61%、66%、68%和76%，同時MC2R在EL3、IL1和IL2區(qū)的同源性更高，分別為84%、83%和80%。

團頭魴MC2R具有G蛋白偶聯(lián)受體視紫紅質(zhì)家族A所共有的保守基序DRY（Asp、Arg、Tyr），以及在多數(shù)MCRs中都具有保守性的3個半胱氨酸（Cys232、Cys246、Cys252）（http：//www.gpcr.org/）和大多數(shù)MCRs都具有的保守基序PMY（Pro、Met、Try）。團頭魴MC2R的Thr137處為該受體的可能的PKC磷酸化位點，推測分析顯示Tyr123，251、Ser32，70，203，214、Thr287為潛在的磷酸化位點。

2.3團頭魴MC2R在不同組織中的表達分析

MC2R的表達量通過實時熒光定量PCR雙標曲線法進行測定和分析，目的基因和內(nèi)參基因的標準曲線數(shù)據(jù)見表3。

MC2R組織分布的結(jié)果顯示，MC2R除了在頭腎中存在大量的表達外，在其他12種組織中也均有不同程度的表達，脾中MC2R也具有很高的表達量，其次在精巢和腦中的表達量也相對較高，其他組織中的表達量則較微量。

2.4捕撈脅迫后團頭魴皮質(zhì)醇和MC2R的調(diào)控變化

捕撈脅迫后，團頭魴血清皮質(zhì)醇水平在1 h內(nèi)迅速升高，在恢復4 h后皮質(zhì)醇水平仍表現(xiàn)出顯著升高的趨勢（P<005），在24 h時逐漸恢復至應激前的水平

捕撈脅迫后，1 h時團頭魴頭腎、脾、精巢和腦中的MC2R表達量均有微弱的升高但差異不顯著，頭腎MC2R表達量4 h時雖仍有升高趨勢，但差異也不顯著；脾、精巢和腦中MC2R的表達變化與頭腎MC2R不同，脾、精巢和腦中MC2R表達量在捕撈脅迫后4 h時呈現(xiàn)顯著的下降；捕撈脅迫后24 h時4種組織中MC2R的表達量均逐漸恢復（圖6）。

3討論

3.1團頭魴MC2R序列分析

本研究克隆得到的團頭魴MC2R氨基酸序列與其他脊椎動物MC2R氨基酸序列具有較高的同源性，系統(tǒng)進化分析顯示，團頭魴MC2R與其他鯉形目魚類，如斑馬魚、鯉和金魚等聚為一支，與傳統(tǒng)的物種進化地位基本一致。

Hoffmann 等認為，GPCRs位于細胞膜表面的N端區(qū)域、胞外環(huán)，跨膜結(jié)構(gòu)在膜表面形成親水性腔的部分氨基酸殘基，以及GPCR與膜結(jié)合區(qū)域暴露于胞外的部分氨基酸殘基都可能參與GPCR與其配體的結(jié)合[17]。然而由于目前缺乏MCRs的晶體結(jié)構(gòu)的構(gòu)造模型，阻礙了MCRs具體配體結(jié)合位點的研究?；谝曌霞t質(zhì)類GPCRs具有相同的激活機制，本研究采用已知的牛視紫紅質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)模型預測了團頭魴MC2R的跨膜結(jié)構(gòu)域[14-15]，結(jié)果顯示，團頭魴MC2R與狼鱸（Dicentrarchus labrax）[10]、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[11]等MC2R的氨基酸結(jié)構(gòu)類似，跨膜區(qū)TM2、TM3、TM6、TM7以及EL3、IL1、IL2等區(qū)域均表現(xiàn)出很高的同源性。而TM2、TM3、TM6和TM7區(qū)域被認為是MCRs與其配體MSH肽類結(jié)合的主要區(qū)域[18-19]。但是哺乳類[5]以及虹鱒[11]等魚類的MC2R被證實

表3熒光定量PCR各基因標準曲線信息

基因標準曲線方程回歸系數(shù)

（r2）擴增效率

（%）MC2Ry=-3.391x+34.0690.999 697.22RPⅡy=-3.259x+33.6470.998 6102.49β-actiny=-3.521x+31.4350.999 992.30注：x為相對濃度的lg值，y為熒光定量PCR獲得的CT值。

不能與MSH肽類結(jié)合來調(diào)節(jié)皮質(zhì)醇的合成，這些區(qū)域在結(jié)合ACTH上的特點還有待考證。鑒于EL3較各TM區(qū)域同源性較高，我們推測EL3可能在MC2R與ACTH的結(jié)合上發(fā)揮著更重要的作用。然而隨著低等脊椎動物MC2R被克隆，研究者發(fā)現(xiàn)軟骨魚類米氏葉吻銀鮫（Callorhinchus milii）[20]MC2R雖然也與團頭魴等魚類跨膜區(qū)具有高度的同源性，但是米氏葉吻銀鮫MC2R不需要MRAP1協(xié)助便能在細胞膜表面表

達，同時與ACTH或MSH等肽類結(jié)合均能使MC2R激活。綜上，MC2R復雜的配體結(jié)合能力，其配體結(jié)合位點的研究有待補充。

3.2MC2R在團頭魴不同組織中的表達

本研究表明MC2R在頭腎中表達量最高，這與頭腎是ACTH作用的主要區(qū)域，并且含有大量的皮質(zhì)素細胞相關(guān)。除在頭腎中大量表達外，團頭魴脾中MC2R的表達量僅略低于頭腎。與本研究結(jié)果類似，在對狼鱸[10]的研究中發(fā)現(xiàn)，除頭腎外，其脾中也檢測到了表達量可觀的MC2R。由于頭腎和脾中存在大量的巨噬細胞，而且多項研究證實應激對多種魚類免疫相關(guān)基因均能產(chǎn)生影響[21-22]，因此MC2R在團頭魴頭腎和脾臟中大量共表達，表明團頭魴體內(nèi)的應激調(diào)節(jié)進一步印證了Agulleiro等[10]的推測，MC2R的激活在調(diào)節(jié)腎間組織合成釋放皮質(zhì)醇的同時，可通過內(nèi)分泌途徑使得應激對免疫應答產(chǎn)生影響。

有研究表明，ACTH在斑馬魚促性腺激素刺激卵泡細胞釋放雌二醇的過程中具有一定的調(diào)控作用[23]。而且在虹鱒MC2R分布的研究中，精巢與卵巢中均檢測到大量表達的MC2R，而本研究中發(fā)現(xiàn)精巢中MC2R具有很高的表達量，約為卵巢的3倍，卵巢中MC2R的表達量較少，條斑星鰈（Verasper moseri）[9]腺MC2R具有與本研究結(jié)果類似的表達比例。這些研究的發(fā)現(xiàn)使得我們推測，魚類ACTH可能通過MC2R的激活通路調(diào)控性腺功能，MC2R在魚類性腺中的作用及其具體機制還有待探討。

雖然MC2R在四肢類的腦中未見明顯表達[24-26]，但是與本研究結(jié)果類似，一些魚類包括虹鱒[11]和條斑星鰈，它們的腦組織中存在大量表達的MC2R，這可能是MC2R參與神經(jīng)中樞對應激源刺激的應答，調(diào)控皮質(zhì)醇的釋放。

3.3捕撈脅迫對團頭魴MC2R表達的影響

如圖6所示，本試驗捕撈脅迫60 s對團頭魴恢復期內(nèi)頭腎MC2R的表達無顯著影響。而有研究表明[11]，急性捕撈應激5 min后恢復1 h時，虹鱒血清ACTH顯著升高，腎間組織MC2R則表現(xiàn)出一定的延遲性，在恢復4 h時MC2R才表現(xiàn)出顯著的升高。本研究未能測得ACTH的表達變化，然而本研究對團頭魴僅應激了60 s，可能由于時間過短，對團頭魴機體MC2R轉(zhuǎn)錄水平未能造成顯著影響，但使得MC2R表達有持續(xù)升高的趨勢，MC2R表達的上調(diào)調(diào)控了下游皮質(zhì)醇水平的顯著變化。

在捕撈應激恢復4 h后皮質(zhì)醇水平經(jīng)較緩慢的增長達到最高，這與紅鯛[27]捕撈應激2 h時皮質(zhì)醇仍有升高類似。此時團頭魴血清皮質(zhì)醇水平處于最大值，但除頭腎外，腦、脾和性腺的MC2R表達量均出現(xiàn)顯著的下降。其可能原因是在應激后1 h內(nèi)，團頭魴由于應激源刺激，各組織MC2R表達量有一定的上調(diào)（圖6），但應激強度不足以造成MC2R表達量產(chǎn)生顯著的變化；同時MC2R的上調(diào)促進皮質(zhì)醇的合成，并能造成血清皮質(zhì)醇水平顯著升高。魚類與哺乳動物類似，皮質(zhì)醇可以通過負反饋作用刺激下丘腦，降低HPI軸的活性[28]。該捕撈脅迫雖不能顯著提高MC2R表達量，但1～4 h時頭腎MC2R表達量的上調(diào)，造成團頭魴皮質(zhì)醇水平的持續(xù)升高，在4 h時達到最高，但由于存在負反饋調(diào)控系統(tǒng)，在皮質(zhì)醇升高到一定程度便能通過負反饋作用于下丘腦，首先使得脾、腦和性腺MC2R的表達水平顯著降低，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、中樞系統(tǒng)以及生殖系統(tǒng)恢復應激前的狀態(tài)。由于機體應激后的調(diào)控十分復雜，涉及到神經(jīng)、內(nèi)分泌以及免疫等一系列活動，同時不同魚類對應激的反應強度也各有不同，因此，還需更多的研究以揭示應激中各調(diào)控因子的作用機制。

值得注意的是，在4 h時團頭魴皮質(zhì)醇水平以及MC2R表達水平分別表現(xiàn)為顯著上升和顯著下降，我們推測此時魚體各組織可能受皮質(zhì)醇作用急劇變化的影響，魚體在此階段機體代謝可能處于最脆弱的階段，受外界因素干擾后極易對機體造成損傷，建議在養(yǎng)殖實踐中，拉網(wǎng)后應盡量保證魚體在此階段內(nèi)不受干擾，以免對魚體造成危害。

本研究成功克隆了團頭魴MC2R基因，序列分析及進化分析顯示團頭魴MC2R氨基酸序列與其他魚類以及四肢類MC2R具有很高同源性，EL3可能是MC2R與配體結(jié)合的重要區(qū)域。團頭魴MC2R組織分布特性與其他動物類似，除了在頭腎中有不同程度的表達外，在脾、腦以及性腺中也有較高的表達量，可能參與相關(guān)系統(tǒng)的生理功能調(diào)控。本研究首次討論了團頭魴應激恢復時MC2R表達與皮質(zhì)醇合成的關(guān)系，結(jié)果顯示在4 h時，皮質(zhì)醇水平與MC2R表達水平均處于顯著水平，推測此時可能是應激后外界環(huán)境的變化對團頭魴機體最易造成損傷的時候。

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