鄒積鑫　尤麗莉　林位夫

摘 要 研究不同取材部位、激素組合配比等因素對3個不同油棕品系葉片愈傷組織培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明：不同部位的油棕葉片以及不同品系的油棕愈傷組織誘導存在極顯著差異；試驗以MS培養(yǎng)基+5 mg/L 2，4-D+10 mg/L TDZ+6 g/L瓊脂+30 g/L糖配比獲得較好的愈傷誘導率；添加2%活性炭可以有效抑制油棕葉片愈傷組織褐化。

關(guān)鍵詞 油棕 ；葉片 ；愈傷組織

分類號 S564+.6

Some Factors Affecting Callus Induction from Oil Palm Leaves

ZOU Jixin1） YOU Lili2） LIN Weifu1）

（1 Rubber Research Institute， CATAS， Danzhou， Hainan 571737；

2 Hainan University， Haikou， Hainan 570228）

Abstract Different parts of leaves and hormone combinations involved in oil palm leave callus culture for three strains of oil palm were studied. The result indicated that different parts of leaves and different strains of oil palm have significant difference in callus induction. The optimum medium components for oil palm callus induction were Murashige-Skoog （MS） medium supplemented with 5 mg·L-12，4-D and 10 mg/L TDZ and 6 g/L agar and 30 g/L sucrose. The supplying of 2% charcoal can prevent explants from browning efficiently.

Keywords oil palm ；leaves ； callus

油棕（Elaeis guineensis Jacg.）為棕櫚科（Palmae）油棕屬（Elaeis）常綠高大喬木，原產(chǎn)于熱帶非洲，是世界最重要的木本油料作物，被譽為“世界油王”，廣泛栽培于南緯10°至北緯15°之間的熱帶地區(qū)，是世界第一大木本油料作物。近年來，隨著油棕組織培養(yǎng)技術(shù)的不斷深入開展，油棕的組培苗表現(xiàn)出良好的產(chǎn)量和品質(zhì)性狀，與常規(guī)種子繁育的油棕品系相比具有明顯的競爭優(yōu)勢，逐漸被認可和應用，是世界油棕種苗產(chǎn)業(yè)未來發(fā)展的新方向[1]。國外的油棕組織培養(yǎng)技術(shù)研究開始較早也比較深入，1970年Staritsky[2]和Rabechault等[3]首次通過油棕種子胚獲得了油棕再生植株；1976年Rabechault等[4]通過油棕葉片獲得再生植株。目前在馬來西亞、印度尼西亞、哥斯達黎加等國家已經(jīng)有油棕組織苗的商業(yè)化生產(chǎn)[5-7]。由于油棕組織培養(yǎng)技術(shù)難度大又具有較高的商業(yè)價值，該技術(shù)已成為商業(yè)機密，極少公開報道。國內(nèi)龔崢等[8]于1987年開展了油棕組織培養(yǎng)的研究，分別以葉片和種胚誘導獲得油棕愈傷組織，但未見獲得完整油棕植株的報道。油棕葉片的初代誘導啟動比較慢、愈傷組織誘導率較低、重復性較差。為建立高效的油棕組織培養(yǎng)體系，本研究以油棕葉片為外植體材料，探討了葉片的不同位置、不同品系、基本培養(yǎng)基和激素的不同配比等因素對油棕愈傷組織誘導的影響，成功獲得高質(zhì)量的油棕愈傷組織，為建立高效油棕組織培養(yǎng)體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所油棕種質(zhì)圃樹齡約10年的油棕單株，包括RYL2、RYL4、RYL6三種油棕品系單株。

1.2 方法

1.2.1 材料前處理

選擇連續(xù)1周內(nèi)天氣晴朗的日子采集油棕葉片。取材前將油棕樹一側(cè)的葉片清理干凈，在油棕生長點上方用鏟刀將油棕芯部取下，剝除外側(cè)葉柄并用75%的酒精對表面進行消毒處理，充分干燥之后將其裝入干燥封閉的容器內(nèi)，運回實驗室備用。

1.2.2 油棕外植體葉片的消毒處理

將采集得到的外植體材料用洗衣粉清洗表面，再用大量的自來水沖洗30 min，接著用75%的酒精擦洗外部及兩端切口，置于超凈工作臺上，再用75%酒精擦洗2 min后，剝?nèi)ゴ瓮鈱?，依照此方法層層消毒后留取芯部較嫩的葉片供接種。先用接種刀將葉片切分成8～10 cm的小段，再將葉片小段切分成1 cm×2 cm的薄片備用。

1.2.3 不同部位的油棕葉片對愈傷組織誘導的影響

以油棕莖干切面中心點為起點，沿螺旋方向標記不同部位的油棕葉片，最中心的葉片標記為0號，依次標記0～12號，將不同編號的葉片分別接種到MS+5mg/L 2，4-D +10 mg/L TDZ+6 g/L瓊脂+30 g/L糖的培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（28±1）℃。每6～7 d觀察1次，每2個月繼代1次，培養(yǎng)12個月后統(tǒng)計愈傷組織誘導情況。每處理50瓶材料，重復3次。

1.2.4 不同品系油棕葉片對愈傷組織誘導的影響

選取RYL2、RYL4、RYL6三個油棕品系各1株，采集油棕嫩葉，選擇生理狀態(tài)較為一致的油棕葉片接種到愈傷組織誘導培養(yǎng)基中。本試驗采用正交試驗設(shè)計方法，以MS為基本培養(yǎng)基附加如下不同濃度激素的2，4-D，NAA，TDZ，各處理編號依次為OPC1～OPC9，具體情況詳見表1。endprint

以上培養(yǎng)均在暗培養(yǎng)條件下進行，培養(yǎng)溫度為（28±1）℃，每隔6～7 d進行觀察記錄，每2個月繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)12個月后統(tǒng)計油棕葉片愈傷組織的誘導情況，每處理50瓶材料，重復3次。

1.2.5 不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑組合對誘導油棕愈傷組織的影響

選擇生理狀態(tài)較一致的油棕葉片，接種到愈傷組織誘導培養(yǎng)基中。本試驗設(shè)計為基本培養(yǎng)基MS附加一定濃度的2，4-D、NAA、TDZ，其中2，4-D濃度水平分別為2、5、10、20 mg/L，NAA濃度水平分別為1、5、10、15 mg/L，TDZ濃度水平分別為2、5、10、20 mg/L，實驗共設(shè)計24個處理，編號依次為OPC3 1～OPC3 24。以上培養(yǎng)在暗培養(yǎng)條件下進行，培養(yǎng)溫度為（28±1）℃，每隔6～7 d進行觀察記錄，每2個月繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)12個月后統(tǒng)計油棕葉片愈傷組織的誘導情況，每處理50瓶材料，重復3次。

1.2.6 活性炭、抗壞血酸對油棕愈傷組織誘導培養(yǎng)中褐化的影響

在配方為MS+5 mg/L 2，4-D +10 mg/L TDZ+30 g/L糖的基礎(chǔ)上分別添加不同濃度的活性炭、抗壞血酸，將油棕葉片接種到不同處理的培養(yǎng)基上，其中添加活性炭為0.1%，0.2%，0.5%三個水平，編號OPM4 1，OPM4 2，OPM4 3；添加抗壞血酸為0.1%，0.2%，0.5%三個水平，編號OPM4 4，OPM4 5，OPM4 6，培養(yǎng)條件為暗培養(yǎng)，溫度為（28±1）℃，每5 d觀察記錄，2個月后統(tǒng)計褐變情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同部位的油棕葉片對油棕愈傷組織誘導的影響

不同部位的油棕葉片愈傷組織出愈率見表2。從表2可以看出，不同部位的油棕葉片愈傷組織出愈率在1.33%～24.67%，最高的部位在7號區(qū)域，最低的部位在12號區(qū)域。試驗結(jié)果表明，編號為3～9區(qū)域的葉片最適合愈傷組織培養(yǎng)，不同部位的油棕葉片由于其生理狀況不同，而導致愈傷組織誘導的情況存在明顯的差異，通過DPS軟件統(tǒng)計分析其p值=1.87×10-11<0.01，差異極顯著。

2.2 不同品系油棕葉片對愈傷組織誘導的影響

表3的試驗結(jié)果表明，不同品系油棕愈傷組織誘導率，在不同種類和濃度的植物外源激素誘導條件下存在差異，其中誘導率最高的是處理OPC2，達到28.67%，最低的是處理OPC4和處理OPC8，為3.33%。通過DPS軟件進行極差分析，結(jié)果表明，TDZ在3個水平、4個因素中極差最大，是主要影響因素，NAA排第二，2，4-D排第三，相對于激素的種類和濃度來說，品系是最小的影響因子，這說明影響不同品系油棕愈傷組織誘導最主要的因素是所采用的激素類型。

2.3 不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑組合對誘導油棕愈傷組織的影響

從表4可以看出，隨著植物外源激素含量的增加，油棕葉片愈傷組織誘導率呈不斷提高的趨勢，但過高的激素濃度組合會降低油棕愈傷組織誘導率。其中最高的誘導率為23號組合，即5 mg/L 2，4-D與10 mg/L TDZ的配比，獲得油棕愈傷組織出愈率為46.00%；最低為6號組合，出愈率為5.33%。在試驗設(shè)置的濃度配比中，在其中1種激素一定的情況下，另1種不同濃度激素處理間存在極顯著差異，p值在（0.002～1.5）×10-6<0.01，但是在2，4-D濃度為5 mg/L時，不同濃度的TDZ處理間p值=0.015>0.01，存在顯著差異，因此2，4-D在該濃度下可能對油棕愈傷組織誘導的作用較為明顯。從表4還可以看出，在植物激素不斷提高的情況下，雖然總愈傷組織的誘導率提高，但胚性愈傷組織的誘導率降低，非胚性的愈傷組織增多。在試驗中也可以觀察到，過高的植物激素使油棕的愈傷組織根化，出現(xiàn)了一些不正常的形態(tài)，如圖1～3所示。

2.4 活性炭、抗壞血酸對油棕愈傷組織誘導培養(yǎng)中褐化的影響

根據(jù)表5的試驗結(jié)果，在油棕葉片愈傷組織誘導培養(yǎng)基中，添加一定濃度的活性炭可有效降低培養(yǎng)物的褐變程度（圖4）。當添加1%的活性炭時，愈傷組織褐化程度明顯低于對照處理和添加抗壞血酸的處理，1%、2%、5%三個處理間對抑制褐變的效果差別不大。同時添加活性炭處理的愈傷組織誘導率要高于添加抗壞血酸處理以及對照的，說明活性炭有助于油棕愈傷組織的誘導。

3 討論與結(jié)論

3.1 外植體材料對油棕愈傷組織誘導的影響

油棕組織培養(yǎng)的研究始于20世紀70年代，關(guān)于油棕外植體材料的選擇，國內(nèi)外均進行了大量的研究。Wahid等[9]分別利用油棕的種胚、根、葉、花成功獲得了油棕愈傷組織，但目前運用最廣泛的也是商業(yè)化程度最高的仍然是采用油棕的嫩葉作為外植體材料[10]。因為首先，所采用的油棕葉片被包裹在油棕莖干里面，基本上是無菌的，消毒非常容易；其次，葉片屬于植物的體細胞，通過葉片細胞誘導愈傷組織獲得再生植株，可以完全遺傳親本的性狀，后代不會變異；第三，油棕葉片采集比較方便，1～2年即可恢復生長，可以多次利用。

利用油棕體細胞進行愈傷組織誘導與利用種子胚誘導相比是非常困難的，這是因為種子胚中細胞的分化程度遠小于體細胞，加上葉片的不同位置其生理狀態(tài)不同，葉片的分化程度也不一致，這也直接決定了其愈傷組織誘導成功的比例。

3.2 外源激素對油棕愈傷組織誘導的影響

植物激素是影響植物組織培養(yǎng)成功與否的一個關(guān)鍵因素，這主要是由于植物激素在植物組織培養(yǎng)中的累積現(xiàn)象及后效作用而影響下代分化，通常以很低的濃度就可以產(chǎn)生很大的作用，但在油棕初代培養(yǎng)階段，所采用的植物激素濃度較其他植物的培養(yǎng)高出很多倍，這可能是由于油棕體細胞本身對某些植物激素的響應程度較低造成的，也是油棕體細胞愈傷組織誘導的一個特點。但是較高的濃度，也會存在后代變異的風險。有報道指出，油棕組培后代在開花和結(jié)果時，會出現(xiàn)一定比例的變異情況，造成油棕的減產(chǎn)[11]，可能是由于油棕初代誘導時過高的激素濃度造成的。因此，在油棕愈傷組織誘導階段，植物外源激素種類和濃度的選擇，值得深入探討和研究。國內(nèi)外在油棕愈傷組織誘導階段采用的激素種類很多，包括2，4-D，NAA，TCPP，Di等。本研究使用了TDZ、2，4-D和NAA 3種植物激素進行研究，這3種激素在作用效果上表現(xiàn)為TDZ>2，4-D>NAA，效果好的植物激素其所需濃度相對較低，培養(yǎng)的結(jié)果也比較理想，但關(guān)于培養(yǎng)后期對油棕組培苗變異程度的影響還有待進一步的觀察。endprint

3.3 活性炭對油棕愈傷組織誘導的影響

褐化是組培過程中外植體內(nèi)的酚類物質(zhì)在有氧氣的條件下，被多酚氧化酶氧化形成有毒的醌類物質(zhì)，聚合形成黑褐色物質(zhì)擴散到培養(yǎng)基中，使外植體切面迅速變成褐色，抑制其他酶的活性，對外植體產(chǎn)生毒害的現(xiàn)象。在木本植物組織培養(yǎng)中褐化現(xiàn)象更為普遍，由于油棕葉片內(nèi)酚類物質(zhì)含量及多酚氧化酶活性較高，因此容易發(fā)生褐化現(xiàn)象，對試驗影響較大。本研究通過添加活性炭和抗壞血酸等物質(zhì)，有效地降低了外植體的褐化現(xiàn)象。

活性炭不僅能夠吸附有毒物質(zhì)，同時也能吸附其他物質(zhì)。從試驗的結(jié)果可知，在油棕愈傷組織誘導形成中，不僅產(chǎn)生多酚等物質(zhì)，同時還有其他未知的代謝產(chǎn)物可能影響油棕愈傷組織的誘導，因此活性炭非褐變率和誘導率都高于抗壞血酸。但是過高的活性炭，在高溫下會水解培養(yǎng)基中的蔗糖，使培養(yǎng)基pH改變，導致培養(yǎng)基不凝固。因此選用2%的添加濃度比較理想。

參考文獻

[1] Soh A C， Wong G， Tang C C， et al. Recent advances towards commercial production of elite oil palm clones， Palm Oil Congr.， 2001[C]. Kuala Lumpur： Malaysian Palm Oil Board， 2001.

[2] Staritsky G. Tissue culture of oil palm （Elaeis guineensis JACQ.） as a tool for its vegetative propagation[J]. Ephytica， 1970， 19（3）： 288-292.

[3] Rabechault H， Guenin G， Ahee J. Colonies cellulaires et formes embryoides obtenues in vitro a patir de cultures d'embryons de palmier a huile（Elaeis guineensis Jacq.var.dura Becc.）[J]. CRAcad Sci Paris， 1970， 270： 3 067-3 070.

[4] Rabéchault H， Martin J P. Multiplication végétative du palmier a huile（Elaeis guineensis Jacq.） a l'aide de cultures de tissus folaires[J]. CRAcad Sci Paris， 1976， 283（16）： 1 735-1 737.

[5] Khaw C H， Ng S K. Performance of commercial scale clonal oil palm（Elaeis guineensis Jacq.）planting in Malaysia， September 29～October 3， 1997[C]. Brisbane： Int Soc Hort Sci Symp， 1997.

[6] Duval Y， Amblard P， Rival A， et al. Progress in oil palm tissue culture and clonal performancein Indonesia and the Co^te d'Ivoire[C]//Proceeding of international planters conference， Kuala Lumpur， Malaysia， 1997： 291-307

[7] Guzman N， Peralta F. Advances in tissue culture propagation of compact Oil palm clones in Costa Rica[J]. ASD Oil palm Papers， 2010， 35： 1-12.

[8] 龔 崢， 崔元方， 陳幸華， 等. 油棕葉片愈傷組織endprint

3.3 活性炭對油棕愈傷組織誘導的影響

褐化是組培過程中外植體內(nèi)的酚類物質(zhì)在有氧氣的條件下，被多酚氧化酶氧化形成有毒的醌類物質(zhì)，聚合形成黑褐色物質(zhì)擴散到培養(yǎng)基中，使外植體切面迅速變成褐色，抑制其他酶的活性，對外植體產(chǎn)生毒害的現(xiàn)象。在木本植物組織培養(yǎng)中褐化現(xiàn)象更為普遍，由于油棕葉片內(nèi)酚類物質(zhì)含量及多酚氧化酶活性較高，因此容易發(fā)生褐化現(xiàn)象，對試驗影響較大。本研究通過添加活性炭和抗壞血酸等物質(zhì)，有效地降低了外植體的褐化現(xiàn)象。

活性炭不僅能夠吸附有毒物質(zhì)，同時也能吸附其他物質(zhì)。從試驗的結(jié)果可知，在油棕愈傷組織誘導形成中，不僅產(chǎn)生多酚等物質(zhì)，同時還有其他未知的代謝產(chǎn)物可能影響油棕愈傷組織的誘導，因此活性炭非褐變率和誘導率都高于抗壞血酸。但是過高的活性炭，在高溫下會水解培養(yǎng)基中的蔗糖，使培養(yǎng)基pH改變，導致培養(yǎng)基不凝固。因此選用2%的添加濃度比較理想。

參考文獻

[1] Soh A C， Wong G， Tang C C， et al. Recent advances towards commercial production of elite oil palm clones， Palm Oil Congr.， 2001[C]. Kuala Lumpur： Malaysian Palm Oil Board， 2001.

[2] Staritsky G. Tissue culture of oil palm （Elaeis guineensis JACQ.） as a tool for its vegetative propagation[J]. Ephytica， 1970， 19（3）： 288-292.

[3] Rabechault H， Guenin G， Ahee J. Colonies cellulaires et formes embryoides obtenues in vitro a patir de cultures d'embryons de palmier a huile（Elaeis guineensis Jacq.var.dura Becc.）[J]. CRAcad Sci Paris， 1970， 270： 3 067-3 070.

[4] Rabéchault H， Martin J P. Multiplication végétative du palmier a huile（Elaeis guineensis Jacq.） a l'aide de cultures de tissus folaires[J]. CRAcad Sci Paris， 1976， 283（16）： 1 735-1 737.

[5] Khaw C H， Ng S K. Performance of commercial scale clonal oil palm（Elaeis guineensis Jacq.）planting in Malaysia， September 29～October 3， 1997[C]. Brisbane： Int Soc Hort Sci Symp， 1997.

[6] Duval Y， Amblard P， Rival A， et al. Progress in oil palm tissue culture and clonal performancein Indonesia and the Co^te d'Ivoire[C]//Proceeding of international planters conference， Kuala Lumpur， Malaysia， 1997： 291-307

[7] Guzman N， Peralta F. Advances in tissue culture propagation of compact Oil palm clones in Costa Rica[J]. ASD Oil palm Papers， 2010， 35： 1-12.

[8] 龔 崢， 崔元方， 陳幸華， 等. 油棕葉片愈傷組織endprint

3.3 活性炭對油棕愈傷組織誘導的影響

褐化是組培過程中外植體內(nèi)的酚類物質(zhì)在有氧氣的條件下，被多酚氧化酶氧化形成有毒的醌類物質(zhì)，聚合形成黑褐色物質(zhì)擴散到培養(yǎng)基中，使外植體切面迅速變成褐色，抑制其他酶的活性，對外植體產(chǎn)生毒害的現(xiàn)象。在木本植物組織培養(yǎng)中褐化現(xiàn)象更為普遍，由于油棕葉片內(nèi)酚類物質(zhì)含量及多酚氧化酶活性較高，因此容易發(fā)生褐化現(xiàn)象，對試驗影響較大。本研究通過添加活性炭和抗壞血酸等物質(zhì)，有效地降低了外植體的褐化現(xiàn)象。

活性炭不僅能夠吸附有毒物質(zhì)，同時也能吸附其他物質(zhì)。從試驗的結(jié)果可知，在油棕愈傷組織誘導形成中，不僅產(chǎn)生多酚等物質(zhì)，同時還有其他未知的代謝產(chǎn)物可能影響油棕愈傷組織的誘導，因此活性炭非褐變率和誘導率都高于抗壞血酸。但是過高的活性炭，在高溫下會水解培養(yǎng)基中的蔗糖，使培養(yǎng)基pH改變，導致培養(yǎng)基不凝固。因此選用2%的添加濃度比較理想。

參考文獻

[1] Soh A C， Wong G， Tang C C， et al. Recent advances towards commercial production of elite oil palm clones， Palm Oil Congr.， 2001[C]. Kuala Lumpur： Malaysian Palm Oil Board， 2001.

[2] Staritsky G. Tissue culture of oil palm （Elaeis guineensis JACQ.） as a tool for its vegetative propagation[J]. Ephytica， 1970， 19（3）： 288-292.

[3] Rabechault H， Guenin G， Ahee J. Colonies cellulaires et formes embryoides obtenues in vitro a patir de cultures d'embryons de palmier a huile（Elaeis guineensis Jacq.var.dura Becc.）[J]. CRAcad Sci Paris， 1970， 270： 3 067-3 070.

[4] Rabéchault H， Martin J P. Multiplication végétative du palmier a huile（Elaeis guineensis Jacq.） a l'aide de cultures de tissus folaires[J]. CRAcad Sci Paris， 1976， 283（16）： 1 735-1 737.

[5] Khaw C H， Ng S K. Performance of commercial scale clonal oil palm（Elaeis guineensis Jacq.）planting in Malaysia， September 29～October 3， 1997[C]. Brisbane： Int Soc Hort Sci Symp， 1997.

[6] Duval Y， Amblard P， Rival A， et al. Progress in oil palm tissue culture and clonal performancein Indonesia and the Co^te d'Ivoire[C]//Proceeding of international planters conference， Kuala Lumpur， Malaysia， 1997： 291-307

[7] Guzman N， Peralta F. Advances in tissue culture propagation of compact Oil palm clones in Costa Rica[J]. ASD Oil palm Papers， 2010， 35： 1-12.

[8] 龔 崢， 崔元方， 陳幸華， 等. 油棕葉片愈傷組織endprint