姚永強，韓 雪，曹銘謙，方 紅，解繼平

(大連大學附屬中山醫(yī)院，遼寧 大連 116001)

緊密連接蛋白Claudin-3在人乳腺癌組織的表達與臨床意義

姚永強，韓 雪，曹銘謙，方 紅，解繼平

(大連大學附屬中山醫(yī)院，遼寧 大連 116001)

目的 探討Claudin-3在不同轉移淋巴結個數(shù)乳腺癌患者中表達的差異。方法 將128例乳腺癌組織標本按淋巴結轉移個數(shù)分組，轉移淋巴結個數(shù)<4個為A組，≥4個為B組，2組各64例。應用實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測2組乳腺癌組織Claudin-3的表達水平并進行比較。結果 A組Claudin-3 mRNA表達低于B組，2組比較有顯著性差異(P<0.05)。不同年齡、激素受體狀態(tài)、CerbB-2、p53、ki67和組織學分級患者Claudin-3表達水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。結論 Claudin-3表達上調可促進乳腺癌的淋巴結轉移，與預后不良有關。

乳腺癌；Claudin-3；淋巴結轉移

WHO最新研究結果顯示，全球每年新增乳腺癌患者超過120萬。乳腺癌作為女性高發(fā)腫瘤，嚴重威脅著女性的生命及健康。每年約有20萬乳腺癌患者死于復發(fā)和轉移。故復發(fā)和轉移是造成乳腺癌患者死亡的主要原因[1]。淋巴結轉移是乳腺癌的主要轉移途徑，淋巴結轉移情況是預測乳腺癌患者復發(fā)及死亡的獨立預后因素。腫瘤細胞向遠處轉移的機制異常復雜。上皮間葉轉化(EMT)是惡性腫瘤細胞轉化為間葉性細胞形態(tài)的過程，是惡性腫瘤細胞向遠處轉移的起始階段，主要表現(xiàn)為腫瘤邊緣細胞(前緣癌細胞)緊密連接的破壞[2]。緊密連接是細胞間連接形式的一種，主要存在于上皮細胞間的連接復合體中。惡性腫瘤細胞發(fā)生EMT的過程可以促使上皮細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的破壞，使上皮細胞獲得一個遷移性的間質表型，促使腫瘤細胞遠距離的轉移形成。Claudin是構成細胞間緊密連接復合體的骨架蛋白之一，研究發(fā)現(xiàn)多種上皮性惡性腫瘤中Claudin蛋白表達異常，Claudin-3表達的改變與很多上皮細胞惡性腫瘤的惡性程度及轉移密切相關[3]。關于緊密連接中Claudin-3的表達與乳腺癌的淋巴結轉移的相關性研究暫無明確定論。本實驗選擇浸潤性導管癌標本128例，采用實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法檢測Claudin-3表達在不同淋巴結轉移個數(shù)患者中的差異，意在探討Claudin-3表達與乳腺癌轉移的關系，為臨床預測乳腺癌患者預后提供新的指標。

1 臨床資料

1.1 一般資料 128例乳腺癌標本采自2012于我院經(jīng)手術治療、術前未進行新輔助治療(新輔助化療及新輔助內(nèi)分泌治療)的乳腺癌標本。均于術中、術后經(jīng)病理證實為浸潤性導管癌。術中清掃淋巴結個數(shù)符合國際標準(清掃淋巴結總數(shù)均≥10個)。入組患者均為女性，年齡38～75歲，中位年齡48歲。為更好地研究轉移期癌組織，標本取自以腫瘤邊緣為中點，向腫瘤組織及正常乳腺組織各進深0.5 cm。標本離體后2min內(nèi)用液氮保存。乳腺癌的診斷及常規(guī)病理資料由2位病理醫(yī)生盲法閱片后提供。按淋巴結轉移多少分為2組：A組患者淋巴結轉移個數(shù)<4個，腫瘤長徑(3.13±1.35)cm，淋巴結轉移數(shù)(2.1±0.8)個；B組患者淋巴結轉移個數(shù)≥4個，腫瘤長徑(3.28±1.26)cm,淋巴結轉移數(shù)(12.1±5.2)個。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞總RNA的提取 采用Trizol(TakaRe公司)按照說明書提取組織細胞總RNA，紫外分光光度法測定RNA的濃度和純度，A260/A280表達在1.8～2.2的標本方可轉為cDNA。

1.2.2 cDNA的合成 總RNA 1.0 μL，5×PrimescriptTMBuffer 2.0 μL，PrimescriptTMRT Enzyme MIX Ⅰ 0.5 μL，Oligo dT Primer 0.5 μL，Random 6 mers 0.5 μL，RNase Free dH2O 5.5 μL。37 ℃孵育15 min，85 ℃ 5 s終止反應。4 ℃保存。

1.2.3 引物和探針的設計與合成 采用Primer designer 5.0軟件設計引物。GAPDH和Claudin-3上下游引物均由大連TakaRa生物制劑有限公司提供。GAPDH為5’-CCATG TAGTTGAGGTCAATGAAG-3’，3’-GGTGAAGGTCGGAGT CAACG-5’；Claudin-3為5’-CTGCTCTGCTGCTCGTGTCC-3’，3’-TTAGACGTAGTCCTTGCGGTCGTAG-5’。

1.2.4 RT-PCR 2×SYBR?Premix Ex TaqTM5.0 μL，PCR Forword Primer 0.5 μL，PCR Reverse Primer 0.5 μL，H2O 3.0 μL，cDNA液 1.0 μL。反應條件：95 ℃ 2 min變性；95 ℃ 20 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)融解曲線分析：95 ℃ 55 s。讀取結果進行分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，等級資料采用秩和檢驗，計量資料采用獨立樣本t檢驗；相關分析采用Spearman秩相關檢驗。P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 2組標本免疫組化染色結果分析 2組患者雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、癌基因(HER2)、核增殖抗原(Ki67)、抑癌基因(p53)表達差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 2組患者臨床病理學參數(shù)比較 例

2.2 乳腺癌組織的Claudin-3 mRNA表達與臨床病理學參數(shù)的關系 對128例乳腺癌標本進行Claudin-3 mRNA檢測結果顯示，A組的Claudin-3 mRNA表達率顯著低于B組(P<0.05)；而不同年齡、激素受體狀態(tài)、CerbB-2、Ki67、p53和組織學分級患者Claudin-3表達水平比較差異均無統(tǒng)計學意義。見表2。

表2 Claudin-3表達與臨床病理學參數(shù)的關系

3 討 論

本實驗128例乳腺癌患者按淋巴結轉移多少分為A、B 2組，但2組乳腺癌組織大小無明顯差異，2組患者淋巴結轉移個數(shù)存在明顯差異的原因用現(xiàn)有的影像及檢驗學指標無法解釋。臨床工作中，筆者通過檢測乳腺癌組織中ER、PR、CerbB-2、p53、Ki67的表達情況來指導患者進一步治療方案及判斷患者的預后。正常人的CerbB-2癌基因為非激活狀態(tài)，部分乳腺癌患者的CerbB-2受體在細胞膜過度表達可以促進乳腺癌細胞的分裂、擴增，促進乳腺癌細胞的遠處轉移。ER、PR的表達是評估乳腺癌患者預后和預測激素治療反應的參數(shù)。Ki-67為增殖細胞核抗原，是一種與細胞周期調控密切相關的蛋白質，其表達的變化可反映細胞的增殖能力，Ki-67的高表達一般預示腫瘤細胞擴增、侵襲、轉移的能力較強，是乳腺癌患者預后不佳的原因。p53蛋白屬于抑癌基因，正常情況下通過參與細胞周期來調節(jié)細胞增殖和分化，其與惡性腫瘤的產(chǎn)生、調控和凋亡等關系密切，其變異與乳腺癌發(fā)生有密切關系。p53蛋白表達陽性者淋巴結轉移較多， 故目前研究認為p53蛋白表達上調提示乳腺癌患者淋巴結轉移的可能性較大。本組結果顯示2組患者在上述檢測指標方面無明顯差異。但2組患者在臨床分期及淋巴結轉移個數(shù)上有明顯差異，而此差異對于患者預后來說有極大的影響。因此除p53、Ki67等癌細胞增殖性指標外，臨床還需要一種新的病理學指標來直接評價乳腺癌組織與淋巴結轉移之間的關系。本研究發(fā)現(xiàn)，A組Claudin-3表達明顯低于B組,故認為Claudin-3表達的改變可能與乳腺癌的浸潤與轉移存在一定的相關性。

轉移是惡性腫瘤的重要生物學特征。大多數(shù)癌癥患者并非死于原發(fā)性癌而是死于轉移性癌。腫瘤轉移的機制非常復雜，涉及多種黏附因子、基質蛋白酶、細胞因子以及相應的信號傳導機制和相關基因的改變。腫瘤前緣癌細胞從原發(fā)腫瘤分離之后，侵襲到周圍的組織，分解細胞與細胞間緊密連接，改變細胞與基質的黏著部位，進行解離去極化，即EMT。通常EMT在正常的胚胎發(fā)育中起著重要作用，與惡性腫瘤細胞的侵襲和轉移也密切聯(lián)系。腫瘤前緣癌細胞為發(fā)生EMT的主要場所，其重要的表現(xiàn)為惡性腫瘤細胞的活化與細胞外基質的降解，其結果是最終僅有少數(shù)腫瘤細胞可以在周圍組織中立足，局部形成新生血管，進而形成一個穩(wěn)定的轉移灶。這其中緊密連接的破壞在乳腺癌侵襲、轉移的過程中發(fā)揮著重要的作用。

Claudin蛋白是由Tsukahara等[4]研究Claudin缺失的成纖維細胞時被發(fā)現(xiàn)和分離的，當時命名為Claudin-1和Claudin-2，迄今已有24個人類的Claudin家族成員被發(fā)現(xiàn)。Claudin蛋白屬于跨膜蛋白,參與維持緊密連接的選擇滲透性和細胞極化，其表達有高度的組織特異性，多種上皮性惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中往往存在著Claudin異常表達[5]。

研究表明，Claudin-3在許多上皮細胞腫瘤中表達上調,且其上調的幅度與腫瘤組織學分級、淋巴結轉移呈正相關，故Claudin-3可作為臨床判斷惡性腫瘤患者預后的生物學標記[6]。Claudin-3作為緊密連接的主要跨膜蛋白，在細胞間傳輸物質能量的過程中起著重要的連接作用。有研究表明，Claudin-3 和Claudin-4 蛋白在卵巢癌細胞中的表達上調，其表達上調與卵巢癌細胞的淋巴結轉移存在一定的相關性；Claudin-3蛋白在正常的卵巢上皮組織細胞中的表達極低甚至不表達，而在上皮性卵巢惡性腫瘤細胞中Claudin-3蛋白表達明顯增高，且其上調的幅度與腫瘤組織學分級、淋巴結轉移呈正相關，這種表達的差異具有統(tǒng)計學意義[7]。我國學者通過對胃癌組織的研究檢測發(fā)現(xiàn)Claudin-1與Claudin-3的表達呈負相關，Claudin-3 表達上調可以使組織的完整性遭到破壞，使腫瘤細胞易于脫離原發(fā)灶，向遠處轉移，從而使腫瘤細胞的轉移能力增強[8]。也有學者對前列腺癌和良性前列腺增生組織的Claudin-3的表達進行檢測發(fā)現(xiàn)，Claudin-3 mRNA在前列腺癌和良性前列腺增生組織中表達水平有明顯差異，其在前列腺癌的表達水平明顯高于良性前列腺組織[9]。Claudin-3表達的上調可以增強惡性腫瘤細胞的侵襲力和生存力，而這種效應的產(chǎn)生可能與增強基質金屬蛋白酶-2(MMP-2 ) 的活性有關。細胞外基質(ECM)是構成細胞基底膜主要成分的一類糖蛋白，是腫瘤細胞侵襲和轉移過程中的組織屏障?；|金屬蛋白酶家族(MMPs)是降解ECM和基底膜(BM)的主要執(zhí)行者。MMPs對ECM的降解作用可以幫助活化的癌細胞EMT后發(fā)生內(nèi)滲。MMP-2和是降解型膠原中最主要的溶解酶之一,不僅可以降解ECM，而且可以破壞BM。Szasz等[10]認為，在惡性乳腺癌組織中MMP-2的表達是明顯增高的,如患者還伴有腋窩淋巴結轉移則其激活比例更加明顯。

Claudin-3是產(chǎn)氣莢膜桿菌腸毒素(CPE)的受體, CPE與細胞表面蛋白Claudin-3結合后能誘導細胞溶解。應用CPE可以顯著抑制鼠乳腺癌細胞的生長，這為乳腺癌的綜合性治療提供了更多的方法，對于預防、治療乳腺癌的復發(fā)和轉移提供新的方法及思路[11]。

總之，Claudin-3表達的異常與乳腺癌的淋巴結轉移存在一定的相關性，可能對于乳腺癌的淋巴結轉移起到促進作用。但Claudin-3在乳腺癌轉移過程中參與的傳導通路、調控因子至今仍不清楚，需要進一步實驗研究證實。而CPE是否可以成為乳腺癌患者綜合性治療的一部分，仍需進行探索及臨床觀察。

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Expression of tight junction protein Claudin-3 in breast cancer tissues and its clinical significance

Yao Yongqiang, Han Xue, Cao Mingqian, Fang Hong, Xie Jiping

(The Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University, Dalian 116001, Liaoning, China)

Objective It is to investigate the difference of Claudin-3 expression between breast cancer patients had different number of metastatic lymph nodes. Methods 128 breast cancer tissue specimens were divided into two groups according to the number of metastatic lymph nodes, the number of metastatic lymph nodes < 4 in Group A, and ≥4 in Group B, there were 64 cases in each group. The different expression of Claudin-3 in Group A and B were examined by RT-PCR and compared. Results The level of Claudin-3 was significantly lower in Group A than that in Group B, there was significant difference (P<0.05). There was no significant difference in patiens with different age, status of hormone receptor, CerB-2, p53, ki67 and histologial type (allP>0.05)。 Conclusion Increasing expression of Claudin-3 is associated with the metastasis of breast cancer and lead to poor prognosis

breast cancer; Claudin-3; lymph nodes metastasis

姚永強，男，副主任醫(yī)師，副教授，從事甲狀腺及乳腺疾患的診療與研究。

10.3969/j.issn.1008-8849.2014.30.008

R737.9

A

1008-8849(2014)30-3329-03

2014-02-05