周青山，馮麗芝，徐 潔，劉 嬌，夏文芳

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院，湖北 武漢 430060)

膿毒癥誘導(dǎo)的急性心腎綜合征的動(dòng)物模型制作與評(píng)價(jià)

周青山，馮麗芝，徐 潔，劉 嬌，夏文芳

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院，湖北 武漢 430060)

目的 觀察腹主動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)+腹腔LPS注射復(fù)制膿毒癥心腎綜合征模型大鼠心臟及腎臟組織病理改變及心腎組織TNF-α表達(dá)的變化。方法 將40只Wistar大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組(A組)，腹主動(dòng)脈阻斷(AAC)組(B組)，內(nèi)毒素(LPS)組(C組)，腹主動(dòng)脈阻斷+內(nèi)毒素組(AAC+LPS)組(D組)。所有動(dòng)物于再灌注后8 h處死，4%多聚甲醛灌注固定后取心臟及腎臟行HE染色觀察心腎組織病理?yè)p害，免疫組化檢測(cè)心腎組織TNF-α表達(dá)的變化。結(jié)果 D組死亡率最高。心臟組織HE染色顯示：A組未見(jiàn)明顯的病理改變；B組心肌組織紊亂，少數(shù)心肌變性、溶解，部分心肌纖維斷裂，毛細(xì)血管充血、擴(kuò)張，肌間隙內(nèi)可見(jiàn)紅細(xì)胞漏出、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，損傷程度較C組略重；C組心肌組織紊亂，心肌細(xì)胞略腫脹，肌間隙內(nèi)可見(jiàn)紅細(xì)胞漏出、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；D組心肌細(xì)胞明顯腫脹，肌間隙增寬，小血管充血明顯，內(nèi)有大量紅細(xì)胞聚集，肌間隙內(nèi)可見(jiàn)大量紅細(xì)胞漏出，纖維變性、壞死，肌間隙炎性細(xì)胞明顯增多聚集、貼壁，甚至出現(xiàn)結(jié)構(gòu)模糊的溶斷現(xiàn)象。心臟TNF-α表達(dá)量為A、C、B、D組依次遞增，B、C組之間比較無(wú)顯著差異，余各組之間均有顯著性差異(P均<0.05)。腎臟HE染色顯示：A組無(wú)明顯病理改變； B組可見(jiàn)輕度損傷；C組較B組病理改變嚴(yán)重；D組最為嚴(yán)重。腎臟TNF-α表達(dá)平均總面積以A、B、C、D組依次遞增；與A組比較，B、C、D組均顯著增加(P均<0.05),但B組與C組比較無(wú)顯著性差異。結(jié)論 本研究成功復(fù)制出了膿毒癥大鼠心腎綜合征模型；并證實(shí)了大鼠在腹主動(dòng)脈阻斷合并膿毒癥時(shí)存在明顯的心腎形態(tài)學(xué)改變和心肌及腎組織損傷；TNF-α作為一種至關(guān)重要的前炎性因子，在腹主動(dòng)脈阻斷合并膿毒癥時(shí)急性心腎組織損傷中發(fā)揮了重要作用。

腹主動(dòng)脈阻斷；膿毒癥；急性腎損傷；急性心肌損傷；膿毒癥心腎綜合征模型

由心或腎任一器官的急、慢性病變引起另一器官的急、慢性病變，或共同病因同時(shí)引起心和腎病變，這樣的心腎共病即為心腎綜合征。有關(guān)心腎綜合征的確切機(jī)制至今仍未明確，可能與血流動(dòng)力學(xué)的改變、內(nèi)皮功能障礙、炎癥反應(yīng)、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)以及交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活有關(guān)[1]。膿毒癥患者同時(shí)發(fā)生的急性心臟和腎臟改變稱為膿毒性心腎功能障礙，根據(jù)Ronco的分類，膿毒癥代表了第五類心腎綜合征的急性原因[2]。但描述膿毒癥時(shí)心和腎二者功能障礙的研究甚是少見(jiàn)，部分原因是目前尚未有合適的動(dòng)物模型能夠高度模擬臨床膿毒性心腎綜合征。本研究旨在應(yīng)用腹主動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)+腹腔LPS注射復(fù)制膿毒癥心腎綜合征模型,為膿毒性心腎綜合征的研究提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法參考。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1 動(dòng)物分組及模型建立 由湖北省疾病控制中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供SPF級(jí)Wistar大鼠40只，體質(zhì)量(250±30)g，雌雄不拘，隨機(jī)分為4組。假手術(shù)組(A組)8只：分離腹主動(dòng)脈但不夾閉，2 h后腹腔注射生理鹽水20 mg/kg；腹主動(dòng)脈阻斷組(B組)10只：腹主動(dòng)脈阻斷20 min后開(kāi)放，2 h后腹腔注射生理鹽水20 mg/kg；內(nèi)毒素組(C組)8只：分離腹主動(dòng)脈但不夾閉，2 h后腹腔注射內(nèi)毒素20 mg/kg；腹主動(dòng)脈阻斷+內(nèi)毒素組(D組)14只：腹主動(dòng)脈阻斷20 min后開(kāi)放，2 h后腹腔注射內(nèi)毒素20 mg/kg。所有動(dòng)物均在術(shù)后8 h開(kāi)胸放血，取心臟及腎臟組織。

1.2 主要試劑 SABC試劑盒和兔抗大鼠TNF-α抗體由武漢博士德生物有限公司提供；DAB顯色劑和脂多糖內(nèi)毒素(LPS)由SIGMA公司提供。

1.3 染色及圖像采集 所取心臟及腎臟組織4%多聚甲醛固定過(guò)夜；常規(guī)脫水，透明，石蠟包埋。所有標(biāo)本4 μm連續(xù)切片多張備用。HE染色：常規(guī)脫蠟入水，行HE染色，光鏡下對(duì)各組進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)對(duì)比觀察；免疫組化染色：參照博士德公司免疫組化SABC法完成，并設(shè)置陰性對(duì)照。在各種參數(shù)一致的前提下，對(duì)各組切片進(jìn)行圖像采集，使用Image-proplus 6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定陽(yáng)性表達(dá)的平均積分光密度(MIOD)。

2 結(jié) 果

2.1 造模情況 A組造模8只，存活8只；B組造模10只，存活8只，死亡率20%；C組造模8只，存活8只；D組造模14只，存活8只，死亡率43%。

2.2 心臟組織病理學(xué)改變 光鏡下可見(jiàn)：A組染色均勻，心肌組織形態(tài)正常，心肌纖維排列規(guī)則，肌間隙未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)及紅細(xì)胞漏出，見(jiàn)圖1； B組心肌組織紊亂，少數(shù)心肌變性、溶解，部分心肌纖維斷裂，毛細(xì)血管充血、擴(kuò)張，肌間隙內(nèi)可見(jiàn)紅細(xì)胞漏出、淤集、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，橫紋不清楚，多核白細(xì)胞聚集、貼壁，損傷程度較LPS組略重，見(jiàn)圖2；C組心肌組織紊亂，心肌細(xì)胞略腫脹或皺縮，部分心肌纖維斷裂，肌間隙內(nèi)可見(jiàn)紅細(xì)胞漏出、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖3； D組心肌細(xì)胞明顯腫脹，肌間隙增寬，小血管充血明顯，內(nèi)有大量紅細(xì)胞聚集，肌間隙內(nèi)可見(jiàn)大量紅細(xì)胞漏出，纖維變性、壞死，肌間隙炎性細(xì)胞明顯增多聚集、貼壁，甚至出現(xiàn)結(jié)構(gòu)模糊的溶斷現(xiàn)象，見(jiàn)圖4。

圖1 A組心臟組織病理學(xué)改變

圖2 B組心臟組織病理學(xué)改變

圖3 C組心臟組織病理學(xué)改變

圖4 D組心臟組織病理學(xué)改變

2.3 心臟免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果 A組心臟下TNF-α MIOD為0.128 3±0.001 9，B組為0.138 0±0.009 3，C組為0.133 7±0.010 7，D組為：0.144 5±0.009 3。心臟TNF-α表達(dá)量以A、C、B、D組依次遞增，B、C組之間比較無(wú)顯著差異，余各組之間比較均有顯著性差異(P均<0.05)。

2.4 腎臟組織病理學(xué)改變 A組腎小球形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)毛細(xì)血管淤血表現(xiàn),腎小囊囊腔充盈,腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，管腔通暢,間質(zhì)無(wú)明顯水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖5。B組多數(shù)皮質(zhì)腎小球皺縮，毛細(xì)血管輕度淤血，紅細(xì)胞滲出，髓質(zhì)腎小球病理改變較輕微,皮質(zhì)腎小囊無(wú)明顯變化，髓質(zhì)腎小囊囊腔變窄,部分腎小管上皮細(xì)胞水腫變性，細(xì)胞扁平、脫落，排列稀疏、紊亂，管腔變窄，部分管腔內(nèi)可見(jiàn)少量細(xì)胞和蛋白管型，腎髓質(zhì)及皮髓交界處、外髓內(nèi)帶的近端小管受損較為嚴(yán)重，主要表現(xiàn)為刷狀緣脫落,可見(jiàn)間質(zhì)輕度水腫，出血，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以髓質(zhì)較為嚴(yán)重,見(jiàn)圖6。C組可見(jiàn)絕大部分腎小球皺縮，毛細(xì)血管淤血，紅細(xì)胞滲出,皮質(zhì)腎小囊與髓質(zhì)腎小囊均可見(jiàn)囊腔明顯變窄,腎小管上皮細(xì)胞腫脹、變性、壞死脫落，刷狀緣壞死脫落，管腔狹窄明顯，并可見(jiàn)大量細(xì)胞或蛋白管型形成,腎間質(zhì)廣泛水腫，出血，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖7。D組多數(shù)腎小球皺縮，毛細(xì)血管嚴(yán)重淤血，紅細(xì)胞滲出，但髓質(zhì)腎小球病理改變較缺血再灌注組為重，但與膿毒癥組相比稍輕,皮質(zhì)腎小囊與髓質(zhì)腎小囊囊腔均明顯變窄,腎小管上皮細(xì)胞水腫變性明顯，刷狀緣脫落嚴(yán)重，官腔閉塞，內(nèi)可見(jiàn)大量細(xì)胞或蛋白管型形成,腎間質(zhì)嚴(yán)重水腫，出血，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖8。

圖5 A組腎臟組織病理學(xué)改變

圖6 B組腎臟組織病理學(xué)改變

圖7 C組腎臟組織病理學(xué)改變

圖8 D組腎臟組織病理學(xué)改變

2.5 腎臟免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果 A組少量腎小球及腎小管可見(jiàn)陽(yáng)性染色，主要在腎小球及腎小管內(nèi)壁線狀表達(dá)，部分腎小管上皮細(xì)胞胞漿可見(jiàn)弱陽(yáng)性染色；B、C、D各組均可見(jiàn)腎小球及腎小管內(nèi)壁線狀表達(dá)，部分腎小管因上皮細(xì)胞損害而無(wú)典型線性表達(dá)，但腎小管上皮細(xì)胞胞漿仍可見(jiàn)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；所有陰性對(duì)照切片無(wú)陽(yáng)性染色。TNF-α表達(dá)平均總面積以A、B、C、D組依次遞增，B組與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，余各組之間比較均有顯著性差異(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組腎臟TNF-α表達(dá)平均總面積(AREA)和MIOD比較

注：①與A組比較，P<0.05；②與B組比較，P<0.05；③與C組比較，P<0.05。

3 討 論

在已有的動(dòng)物模型中，有多種方法可誘導(dǎo)心腎功能障礙。誘導(dǎo)心臟功能障礙最常用的是結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈引起心肌梗死，誘導(dǎo)腎臟功能障礙最常用的技術(shù)是減少腎組織，有單腎切除(UNX)和部分腎切除(SNX),而SNX可致更為嚴(yán)重的腎功能障礙[1]。也有模型不需要外科手術(shù)干預(yù)，如應(yīng)用阿霉素誘導(dǎo)心腎功能障礙，然而誘導(dǎo)心肌病變所需的劑量要遠(yuǎn)大于誘導(dǎo)腎功能障礙所需的劑量，因此要達(dá)到同時(shí)研究二者功能障礙的可能性不是很大[1]。就目前所有的動(dòng)物模型來(lái)說(shuō)，沒(méi)有哪一個(gè)模型能夠完全復(fù)制心腎綜合征的病理生理過(guò)程和臨床特點(diǎn)。

有研究應(yīng)用腹主動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)復(fù)制心腎綜合征模型，但腹主動(dòng)脈阻斷時(shí)間長(zhǎng)短以及結(jié)扎位置都會(huì)影響心腎損傷程度[3-4]。腹主動(dòng)脈阻斷所致缺血再灌注可引起遠(yuǎn)隔臟器損傷，其病理生理改變存在多種學(xué)說(shuō)，普遍認(rèn)為與鈣超載、氧自由基的過(guò)量釋放、中性粒細(xì)胞激活及炎性細(xì)胞因子釋放有重要關(guān)系[5]。其對(duì)心臟的血流動(dòng)力學(xué)影響主要由于阻斷遠(yuǎn)端血流量銳減，近端血流驟增，左心室后負(fù)荷加大，從而引起阻斷后的血壓上升，心率減慢，撤鉗后出現(xiàn)外周阻力降低，可引起血壓降低、心率變快[6]。腹主動(dòng)脈阻斷亦可使血清肌酐、尿素氮含量明顯升高，造成腎損傷[7]。

膿毒性休克時(shí)，有20%的患者會(huì)發(fā)生心肌功能障礙，且有心肌功能障礙的患者死亡率(70%)較無(wú)心血管損傷的患者(20%)明顯增高[8]。引起心肌損傷有多種因素，由于炎癥介質(zhì)過(guò)度激活所誘發(fā)的“瀑布效應(yīng)” 及氧自由基損傷是造成心肌損傷的重要機(jī)制，另腫瘤壞死因子(TNF-α)等炎性遞質(zhì)具有直接的心肌毒性作用，心臟局部增加的炎癥因子是導(dǎo)致心功能障礙的重要因素。研究表明，很大比例的膿毒癥患者存在左室的收縮功能受損[9]。B型腦鈉肽作為心肌損傷的生物標(biāo)志物在膿毒癥患者中也有研究，其水平在嚴(yán)重膿毒癥和膿毒性休克患者中會(huì)增高[10]。經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖的研究表明，膿毒性休克患者的左室射血分?jǐn)?shù)在所有患者中顯著降低，造成左室搏出量嚴(yán)重減少。許多研究也表明了膿毒性腎損傷在危重患者中非常普遍[11]。Ronco等[2]認(rèn)為，膿毒癥導(dǎo)致的微血管炎癥損傷、膿毒性休克時(shí)的血壓過(guò)低和灌注不足可能是導(dǎo)致腎損傷的主要原因。Knotek等[12]對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠的研究提示TNF-α可以由革蘭陰性內(nèi)毒素刺激腎小球系膜細(xì)胞釋放和促進(jìn)腎組織中的白細(xì)胞的遷移和活化，從而導(dǎo)致膿毒癥AKI。體外培養(yǎng)人近端腎小管上皮細(xì)胞的試驗(yàn)?zāi)Ｐ吞崾緝?nèi)毒素、TNF-α和其他促炎癥因子可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡[13]。實(shí)際上，內(nèi)毒素介導(dǎo)釋放的TNF-α能同時(shí)影響腎臟和心血管系統(tǒng)[14]。

無(wú)論是腹主動(dòng)脈阻斷后缺血再灌注還是膿毒癥，炎性因子的表達(dá)及氧自由基損傷都是重要的發(fā)病機(jī)制。在已報(bào)道的心腎衰竭動(dòng)物模型中，“心損及腎、腎損及心”或“心腎共損”的病理程度較輕[15]?；诟怪鲃?dòng)脈阻斷和膿毒癥都可導(dǎo)致心腎功能障礙，提示可以通過(guò)腹主動(dòng)脈阻斷+膿毒癥來(lái)復(fù)制膿毒癥心腎綜合征模型,二者的結(jié)合必然會(huì)加重心腎損傷的程度，達(dá)到預(yù)期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

好的心腎綜合征的模型應(yīng)該能很好地模擬心臟和腎臟的臨床特點(diǎn)、血流動(dòng)力學(xué)以及神經(jīng)遞質(zhì)的改變，這一模型應(yīng)該通過(guò)心腎二者功能的進(jìn)行性損害來(lái)反應(yīng)心腎損傷的特點(diǎn)；就心臟功能來(lái)說(shuō)，應(yīng)該通過(guò)超聲心電圖證實(shí)存在收縮功能障礙或是射血分?jǐn)?shù)的減少以及所致的腎血流量減少；在組織學(xué)水平上來(lái)說(shuō)，心臟應(yīng)該被證實(shí)存在過(guò)度肥大和纖維化；就腎臟功能的損傷來(lái)說(shuō)，應(yīng)該有肌酐水平的上升，出現(xiàn)蛋白尿、蛋白排泄增加，以及腎小球?yàn)V過(guò)率降低；組織學(xué)上應(yīng)證實(shí)存在腎小球硬化或腎間質(zhì)纖維化[1]。參照以往關(guān)于獨(dú)立的腹主動(dòng)脈和膿毒癥的實(shí)驗(yàn)，表明本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)總體上是符合這些要求的。并且本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用腹主動(dòng)脈阻斷+膿毒癥在較短周期內(nèi)實(shí)現(xiàn)了心腎功能的共損，增加了心腎損傷程度。但本實(shí)驗(yàn)僅從心腎的組織學(xué)改變和炎癥因子 TNF-α兩個(gè)方面評(píng)估模型，故還需要進(jìn)一步從血液生化、血流動(dòng)力學(xué)以及其他指標(biāo)進(jìn)行研究以為心腎綜合征模型的建立提供新的支撐。

[1] Szymanski MK,De-Boer RA,Navis GJ,et al. Animal models of cardiorenal syndrome: a review[J]. Heart Fail Rev,2012,17(3):411-420

[2] Ronco C，Costanzo MR，Bellomo R，et al. Cardiorenal syndromes:definition and classification[J]. Contribut Nephrol,2010(164):33-38

[3] Georgakis P,Paraskevas KI,Bessias N,et al. Duration of aorticcross-clamping during elective open abdominal aortic aneurysm repair operations and postoperative cardiac/renal function[J]. J Int Union Angiol,2010,29(3):244-248

[4] Yeung KK,Richir M,Hanrath P,et al. Infrarenal aortic-clamping after renal ischaemia aggravates acute renal failure[J]. Eur J Clin Invest,2011,41(6):605-615

[5] Oyar EO,Kiris I,Gulmen S,et al. Adrenomedullin attenuates aortic cross-clamping-induced myocardial injury in rats[J]. Am J Surg,2011,201(2):226-232

[6] 曲度,曲強(qiáng)，張玹，等. 腹主動(dòng)脈阻斷術(shù)臨床原理及其上中下段安全時(shí)限探討—兼述缺血再灌注損傷機(jī)制與對(duì)策及“二叉樹(shù)耐受法則”[J]. 海南醫(yī)學(xué),2009,20(1):1-13

[7] Oyar EO,Kiris I,Gulmen S,et al. The protective effect of adrenomedullin on renal injury,in a model of abdominal atorta cross-clamping[J]. Thorac Cardiovasc Surg,2012,60(1):5-10

[8] Chelazzi C,Villa G,De-Gaudio AR. Cardiorenal Syndromes and Sepsis[J]. Int J Nephrol,2011,(2011):1-8

[9] Sado D,Greaves K. Myocardial perfusion echocardiography:a novel use in the diagnosis of sepsis-induced left ventricular systolic impairment on the intensive care unit[J]. Eur J Echocardiog,2011,12(1):81-84

[10] Rivers EP,McCord J,Otero R,et al. Clinical utility of B-type natriuretic peptide in early severe sepsis and septic shock[J]. J Inten Care Med,2007,22(6):363-373

[11] Oppert M,Engel C,Brunkhorst FM，et al. Acute renal failure in patients with severe sepsis and septic shock：a significant independent risk factor for mortality: results from the German Prevalence Study[J]. Nephrol Dial Transplant,2008,23(3):904-909

[12] Knotek M,Rogachev B,Wang W，et al. Endotoxemic renal failure in mice: role of tumor necrosis factor independent of inducible nitric oxide synthase[J]. Kidney International,2001,59(6):2243-2249

[13] Jo SK,Lee SY,Han SY，et al. α-melanocyte Stimulating Hormone (MSH) decreases cyclosporine a induced apoptosis in cultured human proximal tubular cells[J]. J Kore Med Sci,2001,16(5):603-609

[14] Wan L,Bagshaw SM,Langenberg C,et al. Pathophysiology of septic acute kidney injury: what do we really know[J]. Critical Care Medicine,2008,36(4):198-203

[15] 王蕾，郝迪，李旭，等. 心腎綜合征動(dòng)物模型研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2013,29(11)：1496-1498

Evaluation of animal models of acute cardio renal syndrome induced by sepsis

Zhou Qingshan, Feng Lizhi, Xu Jie, Liu Jiao, Xia Wenfang

(The People’s Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei, China)

Objective It is to observe the pathology changes and the expression of TNF- α of heart and kidney in rats with cardiorenal syndrome of sepsis model by combing abdominal aortic clamping (AAC) with intraperitoneal injection of LPS. Methods 40 Wistar rats were randomly divided into four groups: sham operated group (Group A), AAC group (Group B), intraperitoneal injection of LPS group (Group C), AAC+LPS group (Group D). All animal were killed after 8 hours’ reperfusion, the cardiac and renal were get out after perfusion fixation with 4% paraformaldehyde, the pathological damage of heart and kidney tissue were observed by HE staining, and the expression of TNF-α in heart and renal tissue were detected by immunohistochemical method.Results The mortality rate of Group D was the highest. The HE staining of Group A of heart tissue was not obvious. Group B was more serious than Group C. And Group D was most serious. The expression of TNF-α of heart was increased from A, C, B, D. Except between Group B and Group, there were significant differences among all groups. The HE staining of Group A of renal tissue was not obvious. Group B showed mild injury. The pathological change of Group C was more serious than Group B. Group D was most serious. The expression of TNF- α of kidney was increased from A, B, C, D (allP<0.05), but there was no significant difference between Group B and Group C. Conclusion The research make cardiorenal syndrome of sepsis successful. The morphological changes and tissue damage of cardiac and renal were obvious in rats with abdominal aorta clamping and sepsis. The function of inflammatory factor TNF-α is very important in this model.

abdominal aorta clamping; sepsis; ccute kidney injury; acute myocardial injury; model of acute cardio renal syndrome induced by sepsis

周青山，男，主任醫(yī)師，從事臨床麻醉及危重病診療工作。

10.3969/j.issn.1008-8849.2014.30.07

R-332

A

1008-8849(2014)30-3325-04

2014-04-30