艾 旭，朱 倩，馬 旭，龍 舟，韋智丹，梅 丹，武軍駐

(1. 湖北省荊門(mén)市第一人民醫(yī)院，湖北 荊門(mén) 448000；2. 武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430072)

白藜蘆醇聯(lián)合放療對(duì)肝癌Bel-7404細(xì)胞體外凋亡的影響

艾 旭1，朱 倩1，馬 旭1，龍 舟1，韋智丹1，梅 丹1，武軍駐2

(1. 湖北省荊門(mén)市第一人民醫(yī)院，湖北 荊門(mén) 448000；2. 武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430072)

目的 探討不同劑量白藜蘆醇聯(lián)合不同劑量放療對(duì)肝癌Bel-7404細(xì)胞凋亡的影響。方法 用MTT法檢測(cè)不同濃度白藜蘆醇(0，25，50，100 μmol/L)對(duì)肝癌Bel-7404細(xì)胞增殖的影響，用熒光顯微鏡檢測(cè)不同濃度白藜蘆醇細(xì)胞凋亡情況,尋找恰當(dāng)?shù)陌邹继J醇的濃度進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。按照不同的放射治療劑量分組如下：A組予單純白藜蘆醇干預(yù)組；B組行放射治療劑量2 Gy+白藜蘆醇干預(yù)；C組行放射治療劑量4 Gy+白藜蘆醇干預(yù)；D組行放射治療劑量6 Gy+白藜蘆醇干預(yù)；檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)侵襲、細(xì)胞凋亡及各組細(xì)胞MMP-2、VEGF的表達(dá)情況。結(jié)果 檢測(cè)結(jié)果顯示,白藜蘆醇可以有效抑制肝癌Bel-7404細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)肝癌Bel-7404細(xì)胞凋亡, 呈濃度依賴(lài)關(guān)系。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇25 μmol/L白藜蘆醇進(jìn)行體外放療的實(shí)驗(yàn)。與A組相比，B、C、D組對(duì)肝癌Bel-7404細(xì)胞的增殖凋亡作用均有顯著性差異(P均<0.05);B組與C、D組有顯著性差異(P均<0.05),C組與D組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論 不同劑量放療聯(lián)合25 μmol/L白藜蘆醇均可提高放射治療后肝癌Bel-7404細(xì)胞凋亡率，降低腫瘤侵襲性；白藜蘆醇可能具有放療增敏的作用。

白藜蘆醇；細(xì)胞凋亡；肝癌Bel-7404細(xì)胞；放療增敏

原發(fā)性肝癌(簡(jiǎn)稱(chēng)肝癌)發(fā)病率呈逐漸升高趨勢(shì)，且死亡率高，手術(shù)治療是目前最主要的治療手段，對(duì)于無(wú)手術(shù)及局部化療(經(jīng)肝動(dòng)脈化療栓塞)條件的患者，放療能取得顯著療效。而如何更進(jìn)一步增加放療的效果，探索肝癌放療的增敏劑無(wú)疑是個(gè)新途徑。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇(Res)在腫瘤的啟動(dòng)、促進(jìn)及發(fā)展三個(gè)階段均表現(xiàn)出抑制甚至逆轉(zhuǎn)腫瘤作用[1]。且白藜蘆醇對(duì)人體多種癌細(xì)胞(肝癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等)均具抑制作用及細(xì)胞毒活性[2-7]。本研究旨在探索白藜蘆醇對(duì)肝癌Bel-7404細(xì)胞體外放療的影響，進(jìn)而影響肝癌患者的預(yù)后。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1 細(xì)胞株 肝癌Bel-7404細(xì)胞株：購(gòu)自武漢大學(xué)典型生物保藏中心。

1.2 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基，F(xiàn)ibronectin，胎牛血清，胰蛋白酶，青霉素-鏈霉素溶液，重組人工基底膜Matrigel，二甲基亞砜(DMSO)，四甲基偶氮唑鹽(MTT)，兔抗人β-actin抗體，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔抗體，兔抗人MMP-2抗體，兔抗人VEGF抗體，Transwell侵襲小室，Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(BeyoECL Plus)，蛋白提取試劑盒等。

1.3 主要溶液的配制 ①Res：純度>95%，無(wú)血清1640培養(yǎng)液稀釋至濃度為0.01 mol/L，密封保存于4 ℃冰箱中備用，每次使用前取適量以無(wú)血清1640培養(yǎng)液調(diào)配至所需濃度；②MTT 的配制：將5 g MTT溶于1 L PBS液中，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜抽濾除菌，配置成5 mg/mL MTT 液-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 藥物濃度選擇實(shí)驗(yàn)

1.4.1 分組及Res處理 培養(yǎng)肝癌Bel-7404細(xì)胞后，將其分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組共4組,第一組為未加Res的空白對(duì)照組,第二組為加Res 25 μmol/L ,第三組為加Res 50 μmol/L,第四組為加Res 100 μmol/L。

1.4.2 MTT比色法檢測(cè)Res對(duì)肝癌Bel-7404細(xì)胞增殖的影響 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌Bel-7404細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，以10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，用血球計(jì)數(shù)板將細(xì)胞稀釋成1×107mL-1，取100 μL細(xì)胞懸液加入含有蓋玻片的96孔板內(nèi)，5% CO2，37 ℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底，分別加入100 μL含有0, 25, 50, 100 μmol/L Res的培養(yǎng)液，5% CO2，37 ℃孵育24 h，每孔加入20 μL MTT溶液(濃度為5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后小心吸去孔內(nèi)MTT溶液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD 490 nm處測(cè)量各孔的吸光值，每組設(shè)5個(gè)重復(fù)孔。結(jié)果顯示，作用于肝癌Bel-7404細(xì)胞48 h后, Res濃度分別為25, 50, 100 μmol/L時(shí)對(duì)肝癌Bel-7404細(xì)胞增殖影響所測(cè)OD值分別為0.522±0.006，0.451±0.018，0.265±0.016，0.117±0.009, 提示各濃度Res作用48 h后均能明顯降低肝癌Bel-7404細(xì)胞增殖(P<0.05), 故本實(shí)驗(yàn)選擇25 μmol/L Res作為基準(zhǔn)濃度。

1.4.3 Annexin V檢測(cè)Res誘導(dǎo)肝癌Bel-7404細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，以10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后種于含有蓋玻片的多孔板內(nèi)，每孔含106～108個(gè)細(xì)胞，再每孔加入2 mL含血清培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h 后去培養(yǎng)液并加藥，分別加入2 mL含有0，25，50，100 μmol/L Res的培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h 后，用冷PBS洗滌蓋玻片上的細(xì)胞2次；在500 μL的Binding Buffer 中加入5 μL AnnexinⅤ-FITC、5 μL PI,混勻；將上述溶液滴加在蓋玻片表面，使長(zhǎng)有細(xì)胞的蓋玻片表面均勻覆蓋；輕輕混勻于2～8 ℃避光條件下孵育5 min；將蓋玻片倒置于載玻片上，在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察，AnnexinⅤ-FITC 熒光信號(hào)呈綠色，PI 熒光信號(hào)呈紅色。結(jié)果顯示本方法能準(zhǔn)確顯示各組細(xì)胞凋亡情況，而25 μmol/L Res更適合對(duì)凋亡率進(jìn)行觀察。

1.5 聯(lián)合實(shí)驗(yàn)

1.5.1 分組及處理 將正常條件下培養(yǎng)的肝癌Bel-7404細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組共4組：A組為僅25 μmol/L白藜蘆醇的空白對(duì)照組；B組為25 μmol/L白藜蘆醇+2 Gy放療組；C組為25 μmol/L白藜蘆醇+4 Gy放療組；D組為25 μmol/L白藜蘆醇+6 Gy放療組，各組均按要求給予相應(yīng)劑量Res和放療。

1.5.2 MTT比色法檢測(cè)Res對(duì)肝癌Bel-7404細(xì)胞增殖影響 各給Res劑量均為25 μmol/L,并同時(shí)給予相應(yīng)劑量化療。操作步驟同1.4.2。

1.5.3 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Res對(duì)肝癌Bel-7404細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)及侵襲能力的影響 將Matrigel凝膠鋪于培養(yǎng)小室濾膜(注意孔徑大小)上，每孔20 μL, 37 ℃過(guò)夜。在膜的另一面涂上纖維粘連蛋白。把約1×105mL-1細(xì)胞200 μL加入到小室內(nèi)。.培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，擦去膜上層細(xì)胞，將膜取下。甲醛室溫固定30 min，,蘇木素染色5 min，乙醇逐級(jí)脫水, 二甲醛透明后, 用刀片裁下膜, 置于載玻片上, 封片觀察。

1.6 Annexin V熒光染色檢測(cè)Res誘導(dǎo)肝癌Bel-7404細(xì)胞凋亡 各組Res劑量均為25 μmol/L并同時(shí)給予相應(yīng)劑量化療。操作步驟同1.4.3。

2 結(jié) 果

2.1 Res聯(lián)合放療對(duì)肝癌Bel-7404細(xì)胞增殖的影響 Res作用于肝癌Bel-7404細(xì)胞48 h后,A、B、C、D OD值分別為0.451±0.018,0.315±0.016,0.227±0.009,0.154±0.012。與A組相比,聯(lián)合放療干預(yù)48 h后均能明顯降低肝癌Bel-7404細(xì)胞增殖(P均<0.05),其抑制肝癌Bel-7404細(xì)胞增殖隨放療治療劑量的增加逐漸增強(qiáng)。見(jiàn)圖1。

圖1 Res聯(lián)合放療抑制肝癌Bel-7404細(xì)胞增殖作用

2.2 Res對(duì)肝癌Bel-7404細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)性影響 不同干預(yù)措施作用于肝癌Bel-7404細(xì)胞48 h后,結(jié)果Res聯(lián)合放療能夠抑制肝癌Bel-7404細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)性,A、B、C、D組肝癌Bel-7404細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(188.33±24.51)個(gè)，(173.00±15.57)個(gè)，(167.67±12.51)個(gè)和(169.67±19.69)個(gè)。與A組相比,聯(lián)合放療干預(yù)作用48 h后能明顯降低肝癌Bel-7404細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)性(P均<0.05),且隨放療治療劑量的增加，其抑制肝癌Bel-7404細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)性也逐漸增強(qiáng)。見(jiàn)圖2。

圖2 Res聯(lián)合放療對(duì)肝癌Bel-7404細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)性影響

2.3 Res對(duì)肝癌Bel-7404細(xì)胞侵襲能力的影響 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度Res對(duì)肝癌Bel-7404細(xì)胞侵襲能力變化,在Res濃度分別為0,25,50,100 mg/L時(shí)結(jié)晶紫染色肝癌Bel-7404細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)(表3.3)分別為(136.62±16.25)個(gè)，(133.50±12.25)個(gè)，(99.25±14.02)個(gè)和(54.25±6.50)個(gè)，與單用Res組相比,聯(lián)合放療干預(yù)作用48 h后可以明顯抑制肝癌Bel-7404細(xì)胞侵襲能力(P均<0.05),且隨放療治療劑量的增加,其抑制肝癌Bel-7404細(xì)胞的侵襲能力逐漸增強(qiáng)。見(jiàn)圖3。

圖3 Res聯(lián)合放療對(duì)肝癌Bel-7404細(xì)胞侵襲的影響

2.4 Res誘導(dǎo)肝癌Bel-7404細(xì)胞凋亡情況 AnnexinⅤ-FITC 熒光信號(hào)呈綠色，PI 熒光信號(hào)呈紅色。細(xì)胞染色呈單純的綠色表明為早期凋亡，綠色和紅色兼有表明為晚期凋亡，呈單純的紅色為死亡。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)如圖4。

2.5 MMP-2、VEGF蛋白的表達(dá)變化 與對(duì)照組相比,隨著放療劑量逐漸增加肝癌Bel-7404細(xì)胞內(nèi)MMP-2蛋白及VEGF蛋白表達(dá)逐漸降低,呈劑量依賴(lài)性。見(jiàn)圖5及圖6。

3 討 論

由于腫瘤細(xì)胞不表達(dá)COX-1，僅有COX-2的異常表達(dá)，而正常組織中少有COX-2表達(dá)，故選擇性COX-2抑制劑可靶向性地作用于腫瘤組織，降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)的前列腺素水平，而不影響正常組織的COX-1及前列腺素水平，因此無(wú)因抑制COX-1及前列腺素水平而造成的正常細(xì)胞組織功能障礙，如因COX-1受抑及前列腺素水平降低所致的胃腸道毒副作用。因此，應(yīng)用選擇性的COX-2抑制劑可作為理想中的放療增敏藥。

圖4 熒光顯微鏡檢測(cè)Res聯(lián)合放療誘導(dǎo)肝癌Bel-7404細(xì)胞凋亡

圖5 Westernblot檢測(cè)各組干預(yù)后對(duì)肝癌Bel-7404細(xì)胞MMP-2蛋白表達(dá)的影響

圖6 Westernblot檢測(cè)各組干預(yù)后對(duì)肝癌Bel-7404細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)的影響

Delmas等[8]進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)表明，白藜蘆醇對(duì)人HepG2及鼠Fao細(xì)胞的增殖均有抑制作用，尤其鼠Fao細(xì)胞更為敏感，在實(shí)驗(yàn)中，向2組細(xì)胞中加入乙醇后，增殖抑制作用增強(qiáng)，這提示白藜蘆醇可以促使更多的細(xì)胞滯留于Sand G2/M 期。同時(shí)，荷瘤大鼠實(shí)驗(yàn)[9]發(fā)現(xiàn)，其對(duì)腫瘤的抑制作用與G2/M時(shí)相細(xì)胞數(shù)增多及腫瘤細(xì)胞凋亡數(shù)增多有很大關(guān)系。

本研究采用白藜蘆醇作為放療增敏劑，觀察聯(lián)合放療應(yīng)用時(shí)，對(duì)肝癌Bel-7404細(xì)胞的增殖、侵襲、凋亡的影響，結(jié)果顯示在放療時(shí)聯(lián)合應(yīng)用白藜蘆醇可以有效增強(qiáng)放射治療的效果，肝癌Bel-7404細(xì)胞的增殖受抑、侵襲減弱、凋亡增加。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一組溶解細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜的依賴(lài)鋅離子的內(nèi)源性蛋白水解酶，能夠?qū)?xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生有效的作用，破壞腫瘤侵襲的組織學(xué)屏障。目前較為一致的觀點(diǎn)認(rèn)為基質(zhì)金屬蛋白酶主要通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)、釋放或激活生長(zhǎng)因子在腫瘤血管生成、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中起作用[10]。關(guān)于MMPs的分類(lèi)至少有20多種，本實(shí)驗(yàn)所研究涉及的MMP-2屬于MMPs的重要組成部分,國(guó)外研究已經(jīng)證實(shí)MMP-2在胃癌組織中高表達(dá)，并與腫瘤進(jìn)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[11],關(guān)于MMP-2促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制主要有[12]：①M(fèi)MP-2通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附的作用，建立新的細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的粘附關(guān)系。②MMP-2的作用底物是Ⅳ型膠原，能直接分解基底膜中的纖維連接蛋白和層粘連蛋白。③通過(guò)調(diào)節(jié)EGF、FGF-1等因子的合成和釋放促進(jìn)腫瘤新生血管的形成。

與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的另一個(gè)重要因素是腫瘤血管的形成[13]，腫瘤血管的形成不僅為腫瘤的生長(zhǎng)提供必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)進(jìn)而遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供了通道，可以說(shuō)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的各個(gè)階段均有賴(lài)于新生血管的形成。目前關(guān)于腫瘤血管形成的具體機(jī)制尚不詳，其涉及復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，在惡性腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中，由于組織增長(zhǎng)過(guò)快，造成局部組織缺血、缺氧，從而誘導(dǎo)VEGF蛋白的表達(dá)，VEGF是血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器[14]，研究已經(jīng)證實(shí)在肺癌、胃癌、宮頸癌等惡性腫瘤組織中均有VEGF過(guò)表達(dá)現(xiàn)象，是目前已知發(fā)現(xiàn)的最重要的血管生長(zhǎng)因子之一，其主要以旁分泌的方式與血管內(nèi)皮上的相關(guān)受體結(jié)合來(lái)發(fā)揮相關(guān)的生物學(xué)功能[15]，通過(guò)增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，促進(jìn)新生血管的形成，加速腫瘤的生長(zhǎng)，增加血管的通透性，從而促使腫瘤細(xì)胞侵入及穿透血管，此外還能促進(jìn)其他凋亡蛋白的表達(dá)，VEGF通過(guò)上述作用參與了腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

運(yùn)用Westernblot檢測(cè)Res聯(lián)合放療對(duì)肝癌Bel-7404細(xì)胞MMP-2、VEGF蛋白的表達(dá)變化，不同干預(yù)措施處理48 h后肝癌Bel-7404細(xì)胞內(nèi)MMP-2、VEGF蛋白的表達(dá)變化明顯，隨著放療劑量逐漸增加，肝癌Bel-7404細(xì)胞內(nèi)MMP-2、VEGF蛋白含量逐漸降低,呈劑量依賴(lài)性。由此可見(jiàn)，Res聯(lián)合放療可以降低肝癌Bel-7404細(xì)胞的MMP-2、VEGF蛋白的表達(dá)量，其抑制肝癌Bel-7404細(xì)胞的侵襲性與MMP-2、VEGF蛋白的表達(dá)相關(guān)。

總之，本研究結(jié)果提示Res能增強(qiáng)肝癌Bel-7404細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。其原因與其可聯(lián)合降低MMP-2、VEGF蛋白的表達(dá)有關(guān)。本研究為肝細(xì)胞肝癌的放療治療提供了一種新的啟示，為開(kāi)發(fā)與研究肝細(xì)胞肝癌放療增敏藥物提供了理論依據(jù)。

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Influence of Resveratrol combined with radiotherapy on apoptosis of liver cancer cells Bel-7404

Ai Xu1, Zhu Qian1, Ma Xu1, Long Zhou1, Wei Zhidan1, Mei Dan1, Wu Zhujun2

(1.The First People’s Hospital of Jingmen City, Jingmen 448000, Hubei, China; 2.Wuhan University, Wuhan 430072, Hubei, China)

Objective It is to approach the influence of radiotherapy combined with Resveratrol on apoptosis of liver cancer cells Bel-7404. Methods The influence of different concentrations of Resveratrol (0, 25, 50 and 100 μmol/L) on apoptosis and proliferation of liver cancer cells Bel-7404 was detected by MTT, the cell apoptosis states was observed by using fluorescence microscopy and to find the appropriate Resveratrol concentration, and then continue to the next step of the experiment with linear accelerator 6 MV X-ray. According to different doses of radiation therapy to divide into 4 groups as follows: Group A, intervened with Resveratrol only; Group B, intervened with radiation dose 2 Gy and Resveratrol; Group C, intervened with radiation dose 4 Gy and Resveratrol; Group D, intervened with radiation dose 6 Gy and Resveratrol. The apoptosis and proliferation and the expression of MMP-2 and VEGF of cells in all groups were detected.Results The detected results showed that Resveratrol could effectively inhibited the growth of liver cancer Bel-7404 cells, inhibition effect was concentration-dependent manner. According to the above experimental results, the selection of 25 μmol/L Resveratrol was used to the experiment of radiotherapy vitro. There were significant differences between Group A with the other groups (allP<0.05) and Group B with Group C or D (allP<0.05). There was no significant difference between Group C and D (P>0.05). Conclusion Different doses of radiotherapy combined with 25μmol/L Resveratrol can increase the apoptosis rate of hepatocellular carcinoma after radiotherapy, reduce tumor invasiveness. Resveratrol may be play the role of sensitizer on radiotherapy.

Resveratrol; apoptosis; hepatocelluler Bel-7404 cells; radiotherapy sensitization

艾旭，男，副主任醫(yī)師，從事普外臨床結(jié)直腸肛門(mén)外科工作。

10.3969/j.issn.1008-8849.2014.30.06

R735.7

A

1008-8849(2014)30-3321-04

2014-04-10