曹思思，鄭宏宇，陳麗艷，方自若，王偉明

(黑龍江省中醫(yī)藥科學院，黑龍江 哈爾濱 150036)

樺褐孔菌(Inonotus obliquus)系擔子菌亞門，層菌綱，非褶菌目，銹革菌科，是一種非常稀缺的藥用真菌［1］，其含有的多糖、三萜類化合物具有降糖、抗腫瘤、抗病毒、抗炎、提高免疫等生物活性，具有很高的藥用開發(fā)前景［2－4］。玉米須是禾本科玉蜀黍植物(Zea mays L.)的花柱和柱頭，是我國傳統(tǒng)中藥材［5］。玉米須中含有多糖、皂苷、黃酮、生物堿等，對嚴重威脅人類生命健康的慢性代謝性疾病有較好的預防和治療作用［6］。樺褐孔菌生長于高寒地區(qū)，自然資源匱乏，嚴重阻礙了其作為治療性藥物的開發(fā)利用［7］。本研究采用雙向固體發(fā)酵的方法［8］，將樺褐孔菌與玉米須進行雙向固體發(fā)酵得到樺須菌質(zhì)(HXJZ)，通過對轉化產(chǎn)物多糖和總三萜的含量測定，確定該菌質(zhì)最佳培養(yǎng)工藝，為該藥用真菌的工業(yè)化生產(chǎn)及新藥源的開發(fā)奠定基礎。

1 試藥與儀器

1.1 試藥

樺褐孔菌(HLJ01，由黑龍江科學院微生物研究所惠贈);玉米須、玉米芯(哈爾濱東金現(xiàn)代農(nóng)業(yè)股份有限公司，批號1209016，產(chǎn)地黑龍江);VB1(沈陽東藥克達制藥有限公司，批號2009024005);酵母膏(北京奧博星生物技術有限公司，批號20100306);馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術有限公司，批號20110310);Sabourand培養(yǎng)基(上海亨代勞商貨有限公司);白樺脂醇對照品(成都瑞芬恩生物科技有限公司，含量≥98%，批號 B－026－130116);KH2PO4、蔗糖、MgSO4、葡萄糖、香草醛、冰醋酸、高氯酸、蒽酚、濃硫酸等(國產(chǎn)分析純)。

1.2 儀器

恒溫培養(yǎng)振蕩器(HNY－2102C，天津市歐諾儀器有限公司);恒溫培養(yǎng)箱(GJ75，齊齊哈爾市醫(yī)療電子器械廠);超凈工作臺(SW－CJ－2D，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司);立式壓力蒸汽滅菌器(HHT4－LX－C50L，上海申安醫(yī)療器械廠);恒溫水浴鍋(YH－8727A，上海精宏實驗設備有限公司);數(shù)控超聲波清洗器(KQ－500DA，昆山市超聲儀器有限公司);紫外可見分光光度計(UV－160A，上海儀電分析儀器有限公司);聚丙烯高溫滅菌袋(亞速旺上海商貿(mào)有限公司)。

2 方法

2.1 液體菌種培養(yǎng) 將300g馬鈴薯切成2～5cm3見方小塊，加入蒸餾水煮沸30min，趁熱過濾，向濾液中加入玉米粉 5.0g，KH2PO43.0g，酵母膏 5.0g，蔗糖25g，MgSO41.5g，VB110mg，加蒸餾水至 1000ml，混合均勻分裝至5個三角瓶，加入直徑4mm玻璃珠6g/瓶，滅菌30min(121℃，0.1 ～0.15Mp)，放涼備用。用接種針刮取樺褐孔菌斜面菌絲體置于100ml無菌水中，渦旋，混合均勻，接種于上述液體培養(yǎng)基中，接種量2ml/瓶，置恒溫搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～10天［120rmp/min，(26 ±2)℃］，待菌絲呈0.5 ～1cm 直徑球狀時，轉移至4℃冰箱冷藏，保存，備用。

2.2 HXJZ的制備 取干燥的玉米須、玉米芯，依次以1:0、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5 配比分組，共六組，分別記為A～F組，加3倍體積水悶潤，每3h進行混合翻動，待水混合均勻后，將物料裝入聚丙烯高溫滅菌袋中，干重90g/袋，濕重 300g/袋，每組平行 3 袋，121℃，0.1 ～0.15Mp滅菌40min，放涼;取2.1項下制備的液體菌種進行接種，每袋2ml，于(28±2)℃恒溫培養(yǎng)約50天。培養(yǎng)結束后，菌質(zhì)于70℃烘干，粉碎，待用。

2.3 平均生長速率的測定 參照韓國國立農(nóng)業(yè)學院張玄酋教授等人的研究，每7天進行2.2項下所制備的菌質(zhì)菌絲體生長高度測量，并計算平均生長速率。

2.4 總多糖、總三萜含量測定

2.4.1 標準溶液的配制

2.4.1.1 葡萄糖標準溶液的配制 精密稱取恒重葡萄糖20mg，置100ml容量瓶中，蒸餾水定容，即為葡萄糖母液。精密吸取上述母液 1、2、3、4、5ml于 10ml容量瓶，蒸餾水定容，得系列濃度的葡萄糖標準溶液。

2.4.1.2 白樺脂醇標準溶液的配制 精密稱取白樺脂醇4.04mg，置25ml容量瓶中，無水乙醇定容，即為白樺脂醇母液。精密吸取上述母液 0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8ml，分別置于 10ml具塞試管中，得系列濃度的白樺脂醇標準溶液。

2.4.2 供試品的制備

2.4.2.1 HXJZ總多糖的制備 精密稱取 HXJZ約2.0g，加水40ml，浸泡2h后，于恒溫水浴鍋100℃浸提2h，重復2次，濾過，合并濾液至100ml容量瓶中，定容，即得。

2.4.2.2 HXJZ總三萜的制備 精密稱取 HXJZ約2.0g，加入95%乙醇30ml，加熱回流提取2次，每次3h，濾過，合并濾液至100ml容量瓶中，用95%乙醇定容，即得。

2.4.3 線性關系的考察

2.4.3.1 葡萄糖標準曲線的制備 分別吸取2.4.1.1系列葡萄糖溶液1.0ml，置于10ml具塞試管中，以水為空白對照，采用蒽酮－硫酸法，在620nm波長處測定其吸光度，以濃度(X)為橫坐標，吸光度(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程為:Y=6.114X+0.125，r=0.9999(線性范圍2 ～10μg/ml)。

2.4.3.2 白樺脂醇標準曲線的制備 分別吸取2.4.1.2系列白樺脂醇溶液，無水乙醇為空白對照，采用香草醛－冰醋酸法，在551nm波長處測定其吸光度，以濃度(X)為橫坐標，吸光度(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程為:Y=0.0404X －0.0127，r=0.998(線性范圍 0 ～22.62μg/ml)。

2.4.4 方法學考察

由于本實驗中總多糖、總三萜含量測定方法較為成熟，故對其方法學的考察部分實驗省略。

2.4.5 加權平均算法確定最佳培養(yǎng)基 采用定期測量菌絲體生長高度來確定HXJZ平均生長速率，同時以該菌質(zhì)總多糖、總三萜含量為指標，運用加權平均算法，確定HXJZ的最佳培養(yǎng)條件。

3 結果

3.1 不同配比固體培養(yǎng)基菌絲體平均生長速率

本實驗記錄樺褐孔菌在固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵第25～50天生長情況，發(fā)酵第40天各組均趨于平穩(wěn)生長，由此得到菌絲體已完成生殖生長，因此以發(fā)酵第40天，袋壁菌絲體生長高度以8cm為基準，設其平均生長速率為1，實驗結果見表1，圖1。

表1 菌絲體平均生長速率測定結果

圖1 不同配比固體培養(yǎng)基菌絲體平均生長速率圖

3.2 HXJZ總多糖、總三萜的含量測定

B～F組HXJZ總多糖、總三萜含量采用紫外分光光度法測得，結果見表2～3、圖2。

3.3 最佳固體培養(yǎng)基確定

在實際生產(chǎn)過程中，生產(chǎn)周期起著權重的作用。因此，菌絲體平均生長速率占整個過程的40%，總多糖，總三萜含量均占30%作加權平均計算，結果見表4。通過以菌絲體平均生長速率、總多糖、總三萜含量作加權計算，最后確定樺褐孔菌與玉米須雙向固體發(fā)酵最佳培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度(28±2)℃，固體物料玉米須與玉米芯的最佳配比為1∶3，培養(yǎng)料干重90g/袋，液體菌種接種量為2ml/袋，靜置培養(yǎng)周期為50天。

表2 HXJZ總多糖含量測定結果

表3 HXJZ總三萜含量測定結果

表4 加權平均數(shù)結果

4 討論

4.1 菌質(zhì)液體培養(yǎng)基的篩選

將樺褐孔菌分別接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯玉米面培養(yǎng)基(見2.1)，Sabourand培養(yǎng)基三種液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)8～10天，參照莊毅等［8］研究實驗方法，結果表明，馬鈴薯玉米面培養(yǎng)基菌絲體干重高于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基0.4%、Sabourand培養(yǎng)基0.52%，且菌種活力最強，這可能與該菌體的生命代謝過程有關，因此本實驗選擇以馬鈴薯玉米面培養(yǎng)基為此菌種的液體培養(yǎng)基。本實驗結果表明，樺褐孔菌在不同配方的培養(yǎng)基選擇上生長具有很大的差異性，選擇適合的培養(yǎng)基進行人工馴化，為其將來的工業(yè)化生產(chǎn)奠定實驗基礎。

4.2 HXJZ的培養(yǎng)周期的確定

樺褐孔菌菌絲體從發(fā)酵第25天初期生長階段到第40天進入生長速率的累進期，通過對菌絲體的形態(tài)觀察，第40天已完成生殖生長，長滿袋壁，第50天菌絲體干重達最大值，且已達到發(fā)酵終點，比野生的生長周期大大縮短。生長過程中觀察發(fā)現(xiàn)A組培養(yǎng)基菌絲沒有生長，D組菌絲體生長速度較快，趨勢平穩(wěn)，生長狀態(tài)較好，菌種活力較強。因此，選擇50天為其發(fā)酵周期。

4.3 HXJZ有效成分測定及培養(yǎng)條件研究

樺褐孔菌含有多種有效成分，臨床試驗證實樺褐孔菌具有降血糖、降血壓、抗癌、抗衰老等作用，而玉米須在降血糖、利尿、利膽、循環(huán)系統(tǒng)方面有較好的治療作用［7］。本實驗以不同配比玉米須、玉米芯作為營養(yǎng)基質(zhì)，接種樺褐孔菌進行雙向固體發(fā)酵，以生物活性成分多糖、三萜含量為考察指標，確定其最佳培養(yǎng)條件。由圖2可知，HXJZ總多糖含量隨玉米須比例的減少而降低，但F組(玉米須:玉米芯為1∶5)總多糖含量又升高，而培養(yǎng)基全部為玉米須時，菌絲體不生長，由此可見玉米須為樺褐孔菌提供功能性成分，玉米芯則作為營養(yǎng)底物，這可能與樺褐孔菌生物學特性有關。三萜化合物主要通過一系列酶催化反應形成的次級代謝產(chǎn)物［9］，且各組培養(yǎng)基總三萜含量相差不大，可見總三萜化合物轉化率較穩(wěn)定。利用該條件將樺褐孔菌與玉米須進行雙向固體發(fā)酵培養(yǎng)可緩解野生子實體資源匱乏問題，生產(chǎn)的多糖，三萜類活性物質(zhì)合理可行，為樺褐孔菌產(chǎn)品的進一步開發(fā)提供了新途徑。

4.4 優(yōu)勢及前景

糖尿病占我國人群發(fā)病率1% ～5%，與癌癥、心腦血管疾病一起視為世界三大疾病，主要以2型糖尿病為主。目前，臨床上治療糖尿病以藥物治療為主，分為胰島素注射劑和口服降糖藥物?？诜堤撬幬锎蟛糠譃榛瘜W性藥物，副作用較明顯。而中藥在治療糖尿病方面卻有較好的優(yōu)勢［10－11］，因此，開發(fā)中藥新藥是目前治療糖尿病最有效的途徑。鑒于樺褐孔菌與玉米須的應用前景［6，12－13］，下一步將對樺褐孔菌與玉米須雙向固體發(fā)酵進行深入系統(tǒng)的研究，在藥理學、藥效學和分子生物學方面有更加突破性進展，開發(fā)研制樺褐孔菌系列中醫(yī)藥保健食品。

［1］陳艷秋，李玉.樺褐孔菌的研究進展［J］.微生物學通報，2005，32(2):124－217.

［2］陳義勇，顧小紅，湯堅.樺褐孔菌多糖的抗腫瘤活性研究［J］.食品與生物技術學報，2011，30(1):65 －69.

［3］李天洙，李香俊，金香子，等.樺褐孔菌影響糖尿病豚鼠糖代謝機理的實驗研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21(8):1959 －1960.

［4］Mizuno T，Zhuang C，Abe K，et al.A ntiumor and hypo glycem ic activities of polysaccharides from the scleritia and mycelia of Inonotus obliquus［J］.Int J Med Mush rooms，1999，1(4):301 － 316.

［5］中華人民共和國衛(wèi)生部藥材標準委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥材標準［S］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1986:12.

［6］王英平，李向高.玉米須化學成分和藥理作用研究進展［J］.特產(chǎn)研究，2004(2):42－46.

［7］黃年來.俄羅斯神秘的民間藥用真菌——樺褐孔菌［J］.中國食用菌，2002，21(4):7 －8.

［8］莊毅.應用藥用真菌新型固體發(fā)酵工程技術研制中藥一類新藥的建立［J］.中藥新藥與臨床藥理，1995，6(4):41.

［9］林庚申，張小青，魏鐵錚，等.樺褐孔菌三萜類物質(zhì)的提取與含量測定［J］.菌物學報，2007，26(3):396 －403.

［10］Li WL，Zheng HC，Bukuru J，et al.Natural medicines used in the traditional Chinese medical system for ther apy of diabetes mellitus［J］.J Ethnopharmacol，2004，92(1):1 －21.

［11］Yeh GY，Eisenberg DM，Kaptchuk TJ，et al.Systematic review of herbs and dietary supplements for glycemic control in diabetes［J］.Diabetes Care，2003，126(4):1277 －1294.

［12］Pegler DN.Useful fungi of the world:Amadou and chaga［J］.My cologist，2001，15(4):153 －154.

［13］景怡，景榮琴，任遠，等.AB－8大孔吸附樹脂分離純化玉米須中總黃酮的研究［J］.中醫(yī)藥學報，2010，38(1):75 －78.