蔡廣知，鄭 丹，張彥飛，貢濟(jì)宇

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117)

微衛(wèi)星DNA指紋圖譜(microsatellite，MS)又稱(chēng)為短串聯(lián)重復(fù)(short tandem repeats，STR)或簡(jiǎn)單序列重復(fù)(simple sequnce repeat，SSR)，是基因組中一段由幾十個(gè)核苷酸組成的序列，此序列一般由幾個(gè)核苷酸(一般為2～4個(gè))為單位多次串聯(lián)重復(fù)組成[1-2]。其中以雙核苷酸重復(fù)最為常見(jiàn)，真核生物的基因組中有大量的微衛(wèi)星DNA存在,約每隔10～550 kb就存在一個(gè)微衛(wèi)星。微衛(wèi)星DNA由于具有特異性的PCR擴(kuò)增、多態(tài)信息容量高、引物通用性好、突變率高、共顯性等特點(diǎn)[3-4]。本文采用微衛(wèi)星鑒別技術(shù)，對(duì)長(zhǎng)白山、黑龍江伊春、遼寧撫順、吉林四海林場(chǎng)4個(gè)地區(qū)的林蛙開(kāi)展了鑒別研究。

1 材料

1.1 儀器 1110型PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司);TGL型臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南星科科學(xué)儀器有限公司)；Dolphin-Doc凝膠成像分析儀(美國(guó)wealtec公司);JY-SP10水平電泳槽(杭州匯爾儀器公司)；電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；微型離心機(jī)(北京六一儀器有限公司)；PCF型超純水機(jī)(成都品成科技有限公司)。

1.2 試劑及耗材 DL500 Marker購(gòu)自寶生物工程有限公司；熒光染料(EB)和單染料購(gòu)于天根生化科技有限公司；50XTAE緩沖液和瓊脂糖均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；PCR mix(英杰生命科技有限公司);DNA提取試劑盒編號(hào)SK-8222和動(dòng)物組織快速直接PCR試劑盒均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

2 方法

2.1 PCR的反應(yīng)體系 PCR反應(yīng)體系為25 μL:PCR反應(yīng)液為12.5 μL(1 x),模板為0.5 μL(0.1～10 ng)，引物為上下游引物各1 μL(0.4 μmol/L)，超純水10 μL，PCR反應(yīng)程序以正品長(zhǎng)白山野生林蛙為模板。

2.2 PCR反應(yīng)程序 95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性50 s；46～60 ℃退火50 s；72 ℃延伸90 s；共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min；8 ℃保存。

2.3 特異性鑒別引物的篩選 根據(jù)GenBank發(fā)表的中國(guó)林蛙的基因序列,以及國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)的報(bào)道，選出11對(duì)微衛(wèi)星引物作為本實(shí)驗(yàn)的引物，最終有5對(duì)能夠穩(wěn)定擴(kuò)增：

引物1：RCMS035 F:AATGGCGAGGAGGTTGACTA

EU377559 R:GCAGTGTTTTATCGCTCGGT

引物2：RCMS042 F:TCTAGCCAGCAGGTAAAACTC

EU377560 R:GAAGTTTGTTCTATTGACCTCTGT

引物3：RCMS092 F:CAAAAGCAGATGGCTGGATAC

EU377562 R:GCTCTATGATAGTGCGTGAAGG

引物4：RCMS029 F:CTATGGACAGAGCAGAAAGAC5

EU377556 R:GCATCTGCTGGTTGGGTAGTG

引物5：RCMS030 F:ACAGGGCAGGACATCTCAGC

EU377557 R:GCATGGGACAAGATACTGGC

3 結(jié)果

3.1 5引物對(duì)不同地區(qū)林蛙的PCR電泳圖譜分析

3.1.1 引物1的PCR電泳圖譜分析 提取4種林蛙DNA模板，加入引物1，退火溫度為52.8 ℃，模板濃度為0.5 μL，循環(huán)次數(shù)為35個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳電壓為120 V，電泳時(shí)間為35 min，上樣量為0.5 μL，在全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)上觀察和分析。由擴(kuò)增后的電泳圖可以看出，長(zhǎng)白山林蛙在240 bp左右有明顯的擴(kuò)增條帶，黑龍江伊春的林蛙在200 bp處有明顯的擴(kuò)增條帶，遼寧撫順林蛙在179 bp處有明顯的擴(kuò)增條帶，吉林四海林場(chǎng)林蛙在220 bp處有明顯的擴(kuò)增條帶。

3.1.2 引物2的PCR電泳圖譜分析 提取4種林蛙DNA模板，加入引物2,退火溫度為55 ℃，后續(xù)操作同引物1。結(jié)果表明，長(zhǎng)白山林蛙在120 bp左右有明顯的擴(kuò)增條帶,黑龍江伊春的林蛙在165 bp處有明顯的擴(kuò)增條帶，遼寧撫順林蛙在135 bp處有明顯的擴(kuò)增條帶，吉林四海林場(chǎng)林蛙在150 bp處有明顯的擴(kuò)增條帶。

3.1.3 引物3的PCR電泳圖譜分析 提取4種林蛙DNA模板，加入引物3進(jìn)行擴(kuò)增，其退火溫度為57 ℃，后續(xù)操作同引物1。結(jié)果表明，長(zhǎng)白山林蛙在200 bp左右有明顯的擴(kuò)增條帶，黑龍江伊春的林蛙在150 bp處有明顯的擴(kuò)增條帶，遼寧撫順林蛙在190 bp處有明顯的擴(kuò)增條帶，吉林四海林場(chǎng)林蛙在230 bp處有明顯的擴(kuò)增條帶。

3.1.4 引物4的PCR電泳圖譜分析 提取4種林蛙DNA模板，加入引物4進(jìn)行擴(kuò)增，其退火溫度為57 ℃，后續(xù)操作同引物1。結(jié)果表明，長(zhǎng)白山林蛙在280 bp左右有明顯的擴(kuò)增條帶，黑龍江伊春的林蛙在180 bp處有明顯的擴(kuò)增條帶，遼寧撫順林蛙在210 bp處有明顯的擴(kuò)增條帶，吉林四海林場(chǎng)林蛙在245 bp處有明顯的擴(kuò)增條帶。

3.1.5 引物5的PCR電泳圖譜分析 提取4種林蛙DNA模板，加入引物5進(jìn)行擴(kuò)增，其退火溫度為55 ℃，后續(xù)操作同引物1。結(jié)果表明，長(zhǎng)白山林蛙在280 bp左右有明顯的擴(kuò)增條帶，黑龍江伊春的林蛙在180 bp處有明顯的擴(kuò)增條帶，遼寧撫順林蛙在200 bp處有明顯的擴(kuò)增條帶，吉林四海林場(chǎng)林蛙在300 bp處有明顯的擴(kuò)增條帶。

3.2 微衛(wèi)星等位基因分型 對(duì)上述5對(duì)引物的正向引物5’端用熒光標(biāo)記進(jìn)行修飾，分別進(jìn)行40只林蛙樣本的動(dòng)物DNA提取，根據(jù)上述PCR條件進(jìn)行等位基因擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物應(yīng)用ABI 3730自動(dòng)測(cè)序儀分型進(jìn)行等位基因測(cè)試；并用GeneMapper ID v3.2軟件對(duì)等位基因進(jìn)行判讀。對(duì)每對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物的等位基因做頻數(shù)分布圖。結(jié)果見(jiàn)圖1～5。

圖1 引物1的基因頻數(shù)分布圖

圖2 引物2的基因頻數(shù)分布圖

圖3 引物3的基因頻數(shù)分布圖

圖4 引物4的基因頻數(shù)分布圖

圖5 引物5的基因頻數(shù)分布圖

由等位基因圖可看出，等位基因的擴(kuò)增結(jié)果與瓊脂糖電泳的電泳結(jié)果無(wú)明顯差異，其片段大小均上下浮動(dòng)在16bp 左右,表明這種方法準(zhǔn)確可靠。中國(guó)林蛙長(zhǎng)白山亞種與其它地區(qū)林蛙的等位基因片段大小頻次分布不一樣，基因片段大小差異比較大，有利于中國(guó)林蛙長(zhǎng)白山亞種與其他種屬林蛙的區(qū)分。

4 討論

采用5種微衛(wèi)星引物對(duì)中國(guó)林蛙長(zhǎng)白山亞種、黑龍江伊春林蛙、遼寧桓仁林蛙以及吉林四海林場(chǎng)林蛙進(jìn)行PCR擴(kuò)增和分析。由5對(duì)引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果可知，在瓊脂糖電泳圖中,每種引物均可以鑒別4種不同產(chǎn)區(qū)的林蛙。為使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確,采用熒光標(biāo)記的方法進(jìn)行等位基因擴(kuò)增，進(jìn)一步驗(yàn)證了微衛(wèi)星鑒別方法的準(zhǔn)確性和可靠性。

微衛(wèi)星PCR結(jié)果雖有差異，但5種引物的擴(kuò)增片段大小差異并不大，實(shí)際應(yīng)用中可采用多種引物分別進(jìn)行鑒別,綜合多引物擴(kuò)增片段的結(jié)果來(lái)評(píng)價(jià)和鑒別。每個(gè)物種的不同引物PCR擴(kuò)增片段的大小均不相同，增加引物進(jìn)行研究可以提高鑒別的精準(zhǔn)度，今后可考慮大量篩選微衛(wèi)星引物，增加選取樣品的品種和數(shù)量，篩選具有更高特異性的微衛(wèi)星引物[5-7]。

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