劉少華，范 寧，李 梁，李慧萍，趙 巖，衛(wèi)功慶，

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院野生動物系，長春 130118)

“鹿角為鹿科動物馬鹿(CgrvuselaphusLinnaeus)或梅花鹿(CervusnipponTemminck)已骨化的角或鋸茸后翌年春季脫落的角基”[1]。據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，鹿角盤具有溫補(bǔ)肝腎、活血消腫、治陰癥瘡瘍、乳癰初起、瘀血腫痛等功效?，F(xiàn)代研究表明，鹿角盤具有抗氧化[2]、抗疲勞、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛[3]、治療骨質(zhì)疏松[4]、乳腺增生等[5]作用。鹿角盤中含有大量的膠原蛋白,是其主要功效成分之一，但是，由于鹿角盤是鹿茸骨化后的產(chǎn)物，質(zhì)地非常堅(jiān)硬，不易粉碎，使得提取、分離較為困難，直接影響了人們對它的深入研究，因此，市場上關(guān)于鹿角盤的加工制品較為罕見[6]。筆者以梅花鹿鹿角盤為原料,研究響應(yīng)曲面法優(yōu)化酶解法提取鹿角盤膠原蛋白技術(shù)，為鹿科動物產(chǎn)品的綜合開發(fā)和深度利用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料 梅花鹿鹿角盤，購于吉林省長春市雙陽區(qū)鹿鄉(xiāng)鎮(zhèn)；胃蛋白酶(1∶3 000)、對二甲氨基苯甲醛、L-羥脯氨酸，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;冰醋酸、濃鹽酸、濃硫酸、硼酸、硫酸銅、硫酸鉀、氯胺T、高氯酸、異丙醇、氫氧化鈉、醋酸鈉、檸檬酸均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器 TG628A分析電子天平(上海皖衡電子儀器有限公司)；UV-1800紫外可見分光光度計(jì)(上海美普達(dá)儀器有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(北京國華醫(yī)療器械廠)；SHA-C數(shù)顯水浴恒溫振蕩器(金壇市江南儀器廠);DHG-9246A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；PHS-W系列微機(jī)型pH計(jì)(上海般特儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 梅花鹿鹿角盤粉常規(guī)成分測定 水分測定:直接干燥法(GB 5009.3-2010)；灰分測定：馬福爐法(GB 5009.4-2010)蛋白質(zhì)測定：凱氏定氮法(GB 5009.5-2010)；脂肪測定：索氏抽提法(GB 5009.6-2003)。

1.3.2 樣品及水解液中膠原蛋白含量的測定 采用對二甲氨基苯甲醛比色測定羥脯氨酸的含量[7]，以羥脯氨酸濃度C為橫坐標(biāo)、吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出樣品中羥脯氨酸的質(zhì)量濃度，再乘以相應(yīng)的系數(shù)即可轉(zhuǎn)換為樣品中膠原蛋白的含量。

1.4 工藝流程 梅花鹿鹿角盤→粉碎(過100目篩)→脫鈣→脫鈣后的梅花鹿鹿角盤粉+0.5 mol/L乙酸+胃蛋白酶→酶解→滅酶→抽濾→酶促酸溶膠原蛋白(PSC)→鹽析→透析→冷凍干燥→酶促酸溶膠原蛋白(PSC)粉。

1.5 鹿角盤膠原蛋白提取工藝的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過預(yù)試驗(yàn)及有關(guān)文獻(xiàn)確定料液比、pH值、加酶量、酶解溫度和酶解時(shí)間5個(gè)單因素的水平分別為：料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL；pH值1.4，1.6，1.8，2.0，2.2；加酶量(E/S)分別為1%、2%、3%、4%、5%；酶解溫度分別為31，33，35，37，39 ℃；酶解時(shí)間分別為2，4，6，8,10 h。每個(gè)水平重復(fù)2次取平均值，考察這5個(gè)單因素對鹿角盤膠原蛋白提取率的影響。

1.6 鹿角盤膠原蛋白響應(yīng)曲面法試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，通過響應(yīng)面分析法和中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用Design-Expert軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。分析因素與設(shè)計(jì)見表1。

表1 試驗(yàn)因素、水平及編碼

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理及圖表繪制采用Excel 2003及Design-Expert 8.0.4軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 梅花鹿鹿角盤粉常規(guī)成分 見表2。

表2 梅花鹿鹿角盤粉基本成分

2.2 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 以羥脯氨酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸光度值和羥脯氨酸濃度的關(guān)系為：Y=0.086 8X+0.002，r2=0.999 3。

2.3 鹿角盤膠原蛋白提取工藝的單因素試驗(yàn)

2.3.1 料液比對鹿角盤膠原蛋白提取率的影響 當(dāng)料液比達(dá)到1∶20時(shí)，膠原蛋白的提取率達(dá)到最大值80.70%,隨后趨于平緩。在實(shí)驗(yàn)過程中可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)料液比太低時(shí)，酶與底物不能充分結(jié)合，使反應(yīng)不完全，從而得到較低的膠原蛋白提取率。隨著料液比的增加，膠原蛋白溶出率增加，但料液比增加到一定程度時(shí)提取液中底物濃度減小，因此確定最適料液比為1∶20。

2.3.2 pH值對鹿角盤膠原蛋白提取率的影響 當(dāng)pH<1.8時(shí)，膠原蛋白提取率隨著pH值的增加而增加,pH1.8時(shí)達(dá)到最大值83.35%，當(dāng)繼續(xù)升高pH值時(shí)，膠原蛋白的提取率反而下降,這可能是由于不同的pH值可影響酶分子的催化能力及酶與底物的結(jié)合能力。極端的pH值可引起酶的變性失活，只有在適宜pH值范圍內(nèi)，酶才能顯示其催化活性，因此確定最適pH值為1.8。

2.3.3 加酶量對鹿角盤膠原蛋白提取率的影響 當(dāng)加酶量達(dá)到4%時(shí)，膠原蛋白提取率趨于平緩，分析原因可能當(dāng)酶在反應(yīng)體系中的總量趨于飽和后，繼續(xù)增加加酶量，膠原蛋白提取率也沒有得到顯著提高，只會增加成本，因此確定最適加酶量為4%。

2.3.4 酶解溫度對鹿角盤膠原蛋白提取率的影響 當(dāng)酶解溫度為37 ℃時(shí),膠原蛋白提取率達(dá)到最大為82.01%，因此確定最佳酶解溫度為37 ℃。

2.3.5 酶解時(shí)間對鹿角盤膠原蛋白提取率的影響 當(dāng)酶解時(shí)間為6 h時(shí)膠原蛋白提取率達(dá)到最大為83.67%,隨后膠原蛋白提取率逐漸降低，分析可能原因是在開始提取時(shí)，膠原還成聚合狀態(tài)，沒有被酶完全解鏈，隨著時(shí)間的延長，大量的膠原分子解鏈，變成可溶性的膠原蛋白，但超過一定時(shí)間，膠原蛋白過度水解，導(dǎo)致膠原蛋白的流失，因此確定最佳酶解時(shí)間為6 h。

2.4 響應(yīng)曲面法對鹿角盤膠原蛋白提取工藝的優(yōu)化 選取pH值(A)、加酶量(B)、酶解溫度(C)、酶解時(shí)間(D)4個(gè)因素,以梅花鹿角盤膠原蛋白提取率(Φ)作為評價(jià)指標(biāo)對工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計(jì)方案及結(jié)果，見表3。

表3 響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在以上29個(gè)試驗(yàn)中，7、11、17、25、29是中心試驗(yàn)，重復(fù)5次試驗(yàn)來估計(jì)試驗(yàn)誤差。利用Design Expert軟件對29個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行回歸分析得出二次模型方差分析表。如表4所示。

表4 二次多項(xiàng)模型方差分析表

注：**表示P<0.01,表示有極顯著差異;*表示P<0.05,表示有顯著差異。

利用Design Expert軟件，進(jìn)行多元回歸擬合，獲得鹿角盤膠原蛋白提取率對編碼自變量料液比、加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間、pH值的二次多項(xiàng)回歸方程：Φ=83.00-2.66A+2.98B-7.98C-4.49D+6.40AB-2.38AC-4.25AD+1.78BC+4.10BD-7.05CD-6.68A2-6.17B2-10.65C2-1.76D2。

由表4可知，該模型顯著回歸,應(yīng)用該模型對試驗(yàn)真實(shí)值進(jìn)行分析和預(yù)測是合理的。pH值、加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間4個(gè)因素對膠原蛋白提取率影響的，主次順序依次為:酶解溫度>酶解時(shí)間>加酶量>pH值。失擬項(xiàng)的p值為0.011 5，說明失擬項(xiàng)不顯著，模型的擬合性較好。RSN為12.048>4,因此,此模型可以對鹿角盤膠原蛋白提取工藝結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。

在回歸模型方差分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)得到的回歸二次方程，利用Design Expert軟件作pH值、加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間對膠原蛋白提取率影響的響應(yīng)曲面圖，分析兩個(gè)因素交互作用對鹿角盤膠原蛋白提取率的影響。

結(jié)果：各因素之間的交互作用對膠原蛋白提取率的影響的主次順序?yàn)?CD>AB>AD>BD>AC>BC，其中CD、AB之間的交互作用有極顯著差異，AD、BD之間的交互作用有顯著差異，AC、BC之間的交互作用沒有差異。

為確定最佳酶解工藝參數(shù)，對所得方程進(jìn)行逐步回歸，刪除不顯著項(xiàng)，然后求一階偏導(dǎo)，并令其為0，可得膠原蛋白提取率達(dá)到最大值時(shí)的工藝條件：pH1.82、加酶量3.96%、酶解溫度36.88 ℃、酶解時(shí)間4 h；考慮實(shí)際情況將其優(yōu)化后的條件修正為pH 1.8、加酶量4%、酶解溫度37 ℃、酶解時(shí)間4 h。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取10 g(精確到0.000 1 g)脫鈣后的梅花鹿托盤粉3分,按照實(shí)際情況優(yōu)化后的工藝條件pH 1.8、加酶量4%、酶解溫度37 ℃、酶解時(shí)間4 h進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到鹿角盤膠原蛋白提取率為80.10%,與預(yù)測值基本一致，說明通過響應(yīng)曲面法預(yù)測得到的優(yōu)化工藝參數(shù)準(zhǔn)確、可靠，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

3 小結(jié)

筆者在以往研究[8-10]的基礎(chǔ)上采用乙酸與胃蛋白酶相結(jié)合的方法提取鹿角盤中的膠原蛋白。

響應(yīng)曲面法已成功應(yīng)用于優(yōu)化酶催化反應(yīng)的處理?xiàng)l件如pH值、加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度等。響應(yīng)曲面法在評估有效因素和數(shù)學(xué)模型等方面能夠準(zhǔn)確描述相互作用的獨(dú)立變量之間的相關(guān)關(guān)系[11-12]。李莉等[13]采用響應(yīng)面法優(yōu)化酶法提取大鯢皮膠原蛋白工藝,得出大鯢皮膠原蛋白提取率可達(dá)到66.99%。嚴(yán)子軍等[14]采用響應(yīng)面優(yōu)化酶溶性羅非魚鱗膠原蛋白的提取工藝,得出膠原蛋白的提取率為13.12%。任國艷等[15]采用響應(yīng)面法優(yōu)化胃蛋白酶提取草魚魚鰾膠原蛋白，得出膠原蛋白實(shí)際提取率為17.82%。筆者利用Design Expert軟件，應(yīng)用響應(yīng)曲面法，對梅花鹿鹿角脫盤粉的膠原蛋白提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到的優(yōu)化工藝參數(shù)：pH為1.82、加酶量為3.96%、酶解溫度為36.88 ℃、酶解時(shí)間4 h；考慮實(shí)際情況，將其優(yōu)化后的條件進(jìn)行修正后，膠原蛋白提取率為80.10%。試驗(yàn)過程中得到的膠原蛋白僅為粗品，后續(xù)試驗(yàn)將對鹿角盤膠原蛋白的分離、純化、理化性質(zhì)及其酶解產(chǎn)物生物活性進(jìn)一步研究。

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