徐 巖，許佳明，何 璐，姬朝光，黃曉巍*

(1.長春中醫(yī)藥大學，長春 130117；2.吉林大學基礎醫(yī)學院，長春 130021)

鹿茸多肽是從新鮮鹿茸中提取的一類多肽類物質，具較強的生物活性，鹿茸多肽具促進細胞修復，誘導細胞分化等多重作用[1]，并具有抗腫瘤等作用[2]。盡管鹿茸多肽抗腫瘤的確切機制尚不十分清楚，但研究表明，鹿茸多肽的抗腫瘤作用可能通過不同的信號傳導通路，抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤新生血管形成，抑制腫瘤細胞侵襲和轉移。鹿茸多肽對人膠質瘤細胞的增殖抑制作用及細胞周期調節(jié)作用未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞系，人膠質瘤細胞(U251)腫瘤細胞系由吉林大學免疫學系保存；鹿茸多肽，長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院實驗中心提供；碘化丙啶PI(美國Sigma公司)，以PBS配制成1.0 mg/mL濃度，過濾除菌后避光備用；MTT(美國Gibco公司)，臨用前以PBS配制成5 mg/mL濃度，過濾除菌后避光備用；二甲基亞砜DMSO和0.25%胰蛋白酶(美國Amresco公司)；RPMI-1640(美國Gibco公司)；標準胎牛血清(杭州四季青生物科技有限公司)。

1.2 儀器 標準超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)；MCO-17AIC型CO2孵箱(日本三洋公司)；DT5-3型低速自動平衡離心機(北京醫(yī)用離心機廠)；倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；Multiskan Ascent酶標儀(芬蘭Labsystems公司)；BD FACSCanto II流式細胞儀(美國BD Biosciences)。

1.3 方法

1.3.1 U251細胞株傳代培養(yǎng)條件 U251細胞貼壁生長在含有10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 mg/L的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中。在37 ℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱內傳代培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化，每2～3天消化1次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3.2 試劑的配制 將鹿茸多肽溶解在PBS配制成1.0 mg/mL濃度，過濾除菌后，分裝后-20 ℃?zhèn)溆?。實驗當日用不完全培養(yǎng)基配制鹿茸多肽工作液。

1.3.3 細胞生長抑制率測定(MTT法) 取對數(shù)生長期U251腫瘤細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，用完全培養(yǎng)基制成1×107細胞懸液。加入96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)24 h后，更換含有50，100，200，400，800 μg/mL鹿茸多肽的培養(yǎng)液，對照組為完全培養(yǎng)基，每組設12個復孔，培養(yǎng)48 h后傾去培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)10 μL，繼續(xù)孵育4 h，傾去MTT溶液，每孔加DMSO 100 μL，振蕩10 min然后在酶標儀上570 nm波長處測吸光度(OD值)。

1.3.4 細胞周期變化的檢測(FCM法) 取對數(shù)生長期U251細胞接種至50 mL培養(yǎng)瓶中,細胞濃度為5×106個/瓶。培養(yǎng)24 h后，更換含有50，100，200，400，800 μg/mL鹿茸多肽的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，對照組為完全培養(yǎng)基。然后用0.25%胰酶消化細胞，離心(1 000 r/min,5 min),PBS漂洗并重懸；用終濃度50%冷乙醇4 ℃固定過夜，用PBS洗脫乙醇2次，3 000 r/min,10 min；加碘化丙啶(PI)染色，終濃度為50 μg/mL,4 ℃避光染色30 min，用FACS Calibur流式細胞儀進行細胞周期分析。

2 實驗結果

2.1 鹿茸多肽對U251腫瘤細胞的增殖作用的影響 MTT法檢測結果表明，與對照組比較,鹿茸多肽組腫瘤細胞抑制率顯著增加，抑制率隨藥物濃度的增加，呈現(xiàn)濃度依賴性。表明鹿茸多肽對腫瘤細胞的增殖有明顯的抑制效應。結果見表1。

表1 不同劑量鹿茸多肽對腫瘤細胞增殖抑制作用的比較(n=12)

鹿茸多肽/(μg/mL)OD570 nm均值抑制率/% 00.353 — 500.331 6.231000.29516.432000.27821.254000.25727.208000.24530.59

2.2 鹿茸多肽對U251腫瘤細胞周期的變化的影響 流式細胞儀檢測結果表明,從圖1中可以看到在二倍體峰前出現(xiàn)了一個凋亡峰，凋亡峰所占的百分比分別為0.57%、0.68%，1.42%,1.82%，2.23%?？梢姷绞勾罅刻幱谠鲋称诘募毎铚贕0/G1期，不能進行增殖而表現(xiàn)為G0/G1期比例增高，部分細胞發(fā)生凋亡，其凋亡峰是低無到高，且逐漸增高,與對照組相比有一定差異，見表2。

表2 不同劑量鹿茸多肽對U251腫瘤細胞細胞周期的影響

3 討論

細胞凋亡是腫瘤細胞抑制的重要路徑之一，許多抗腫瘤藥物通過誘導腫瘤細胞凋亡而起作用[3]。誘導腫瘤細的機制研究受到了人們的廣泛關注。 細胞凋亡[4]指在一定生理和病理情況下機體為維護內外環(huán)境的穩(wěn)定,通過基因調控，誘導、啟動來實施細胞凋亡，是自身細胞的主動死亡過程。細胞凋亡與增殖是一對并存的矛盾，正常狀況兩者維持動態(tài)平衡，當細胞增殖與死亡的速度平衡失調時，則會增加腫瘤發(fā)生的可能性。 許多抗腫瘤藥物可以通過干擾腫瘤細胞生長、代謝、增殖等過程，最終觸發(fā)腫瘤細胞發(fā)生凋亡，從而達到治療腫瘤的目的。 研究表明，許多中藥的抑瘤作用[5]通過誘導腫瘤細胞凋亡機制實現(xiàn)的,因此中藥抗腫瘤作用機制的研究有助于人們尋找適合的藥物治療腫瘤，同時更能進一步提示凋亡機制的發(fā)生[6-7]。 鹿茸多肽是從新鮮鹿茸中提取的一類多肽類物質，具較強的生物活性[8],鹿茸多肽對骨組織、神經纖維損傷的修復有明顯的促進作用[9]。對細胞的增殖和分化有明顯的調節(jié)作用。 細胞發(fā)生中一個密切而又獨立的危險事件就是細胞周期變化，藥物在誘導腫瘤細胞凋亡時多伴有細胞周期的阻滯，通過阻止細胞從G1期進入S期，使細胞阻滯于G1期,并使G1期細胞凋亡。 本實驗研究了鹿茸多肽對腫瘤細胞生長增殖的抑制及其誘導細胞凋亡作用。通過對鹿茸多肽作用于細胞48 h后的細胞形態(tài)的觀察和MTT法細胞生長抑制率[10]的測定及流式細胞儀[11]檢測細胞周期。結果表明,大量處于增殖期的細胞阻滯于G0/G1期，不能進行增殖而表現(xiàn)為G0/Gl期比例增高,部分細胞發(fā)生凋亡，凋亡峰隨著濃度的增加而增高，說明鹿茸多肽誘導腫瘤細胞凋亡作用存在著濃度依賴性。

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