肖井雷，康 嵐，朱鍵勛，姜大成

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117)

林蛙油為中國(guó)林蛙(RanatemporariachensinensisDavid)雌蛙的干燥輸卵管，又稱哈蟆油，是一種藥食同源的珍貴佳品[1]。氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MC)被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜樣品的定性定量鑒別，其方法具有靈敏度高、速度快、時(shí)間短、精密度高及效能高等特點(diǎn)。激素類成分在臨床中廣泛使用，尤其是雌激素類成分可以在婦女進(jìn)入絕經(jīng)期后升高體內(nèi)的雌激素水平，用來(lái)預(yù)防或治療婦女更年期綜合癥等疾病[2]。本實(shí)驗(yàn)利用GC/MS方法對(duì)林蛙油中激素類成分進(jìn)行定性定量分析。

1 儀器與試劑

QP2010 GC-M氣質(zhì)聯(lián)用儀(日本島津), 配不分流毛細(xì)管柱進(jìn)樣器及GC/MS化學(xué)工作站；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)；DT5-2型低速臺(tái)式離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司)；FA10048電子天平(上海佑科有限公司)。氯仿(分析純)，乙腈(分析純)，石油醚(分析純)，甲醇(分析純)，氯化鈉，無(wú)水硫酸鈉等。林蛙油為自行剝?nèi)〉牧滞茌斅压?，林蛙采?gòu)于吉林省撫松縣，干燥后備用，本品經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室姜大成教授鑒定為中國(guó)林蛙(RanatemporariachensinensisDavid)雌蛙的輸卵管。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 林蛙油供試品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取林蛙油粉末試樣2.0 g，加入0.5 g氯化鈉，加15 mL氯仿和5 mL水，勻漿1 min后，超聲30 min，置于離心機(jī)中5 000 r/min離心10 min,上層水液棄去，取氯仿層，再次加入氯仿和水重復(fù)1次。合并氯仿層,加入適量無(wú)水硫酸鈉去除水分，過(guò)濾于蒸發(fā)皿中，揮干氯仿，用10 mL乙腈溶解至離心管中，加入3 mL石油醚混勻后，3 000 r/min離心2 min，棄去石油醚層，重復(fù)一次至下層無(wú)色，于65 ℃水浴蒸干，加2 mL甲醇混勻，即得[3-4]。

2.2 GC-MS的測(cè)定條件 氣相色譜條件：DB-5 MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 mm)；He載氣(≥99.999%)；柱壓60.2 Pa；載氣恒線速度37.2 cm/s；不分流進(jìn)樣0.2 μL；進(jìn)樣口溫度為250 ℃。色譜柱升溫程序：初始溫度120 ℃，保留2 min，以15 ℃/min升至250 ℃，保留2 min，以5 ℃/min升至300 ℃，保留5 min[5-6]。

質(zhì)譜條件：電子能量70 eV；燈絲電流65 μA；檢測(cè)電壓1 102 V；EI源溫度230 ℃；接口溫度280 ℃；溶劑延遲時(shí)間3 min[6]。

3 結(jié)果與討論

將林蛙油供試品溶液按上述色譜條件進(jìn)樣，從林蛙油供試品溶液中共鑒定出5個(gè)化合物，通過(guò)NIST及SADITE譜圖庫(kù)檢索對(duì)這5個(gè)化合物進(jìn)行鑒別，并利用峰面積歸一法對(duì)5個(gè)化合物進(jìn)行了相對(duì)含量的測(cè)定，氣質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1，分析結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 林蛙油供試品溶液化學(xué)成分及相對(duì)含量

圖1 林蛙油供試品溶液氣質(zhì)色譜圖

由表1可知，初步分析得到5種激素類成分，其中除膽固醇(峰4號(hào))和雌二醇(峰5號(hào))在其他文獻(xiàn)中報(bào)道過(guò)[7-8]，乙酸雄甾酮(峰1號(hào))、前列腺素(峰2號(hào))及美屈孕酮(峰3號(hào))均為首次從林蛙油供試品中分離得到。已有研究表明激素類成分對(duì)人類健康可能是一把“雙刃劍”，長(zhǎng)期應(yīng)用雌激素易產(chǎn)生高血壓、水腫等副作用，因此應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)對(duì)其安全性的研究[9]。

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[4]徐英江,田秀慧,張秀珍,等.超高液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)水產(chǎn)品8種雌激素的測(cè)定[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2010,29(2):152-156.

[5]王玉飛,周凱,李繼革.GC/MS/MS法同時(shí)測(cè)定海產(chǎn)品中四種雌激素殘留[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2006,26(1):21-23.

[6]鄒龍,林洪,江潔.氘代同位素內(nèi)標(biāo)氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定魚(yú)貝類肌肉中β-雌二醇?xì)埩鬧J].分析化學(xué)研究報(bào)告,2007,35(7):983-987.

[7]陳燕超,胡巖,王試涵,等.GC-MS法對(duì)蛤蟆油中甾體類化合物的分析[J].長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2010,26(5):660-661.

[8]劉娟,劉爽,劉程誠(chéng).高效液相色譜法測(cè)定蛤蟆油中雌二醇的含量[J].遼寧中醫(yī)雜志,2010,38(1):138-139.

[9]Kenji Takakura,K.T.,Wang Huaqin.Follicle-stimulating hormone receptor gene mutations are rare in Japanese women with premature ovarian failure and polycystic ovary syndrome [J].Fertility and Sterility,2001,75(1):207-209.