劉 毅，寧尚磊，陳雨信，徐克森，壽楠海

山東大學(xué) 齊魯醫(yī)院肝膽外科，濟(jì)南250012

原發(fā)性肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一［1］。肝部分切除是目前治療肝癌最有效的局部治療手段之一。雖然肝臟外科技術(shù)取得較大進(jìn)展，但接受肝部分切除的患者術(shù)后5年內(nèi)仍有50%～60%死于腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，這已成為影響肝癌患者術(shù)后療效和獲得長期生存的關(guān)鍵因素之一。在肝切除手術(shù)中，術(shù)中出血幾乎不可避免，而出血量的多少被認(rèn)為是術(shù)后恢復(fù)和預(yù)測預(yù)后的重要指標(biāo)，因此控制切肝過程中出血的各種方法在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用［2］，但這又會(huì)導(dǎo)致整個(gè)或部分肝臟缺血再灌注的發(fā)生。Ku等［3］及Yoshimoto等［4］報(bào)道手術(shù)相關(guān)缺血再灌注損傷會(huì)對大鼠肝臟腫瘤門靜脈轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響。van der Bilt等［5］觀察到再灌注后期肝實(shí)質(zhì)的壞死而非早期的肝實(shí)質(zhì)損傷是造成肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要因素。目前缺血再灌注影響肝癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不清楚，Lenglet等［6］、Tamagawa 等［7］及 van der Bilt等［8］認(rèn)為這種現(xiàn)象可能與缺血再灌注導(dǎo)致再灌注的肝組織內(nèi)某些分子表達(dá)上調(diào)有關(guān)。有研究表明肝移植時(shí)肝臟缺血再灌注損傷會(huì)誘導(dǎo)血管細(xì)胞黏附因子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)過表達(dá)［9-10］。VCAM-1作為一種促進(jìn)異種細(xì)胞間黏附的黏附因子，在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［9］。在體外實(shí)驗(yàn)中，VCAM-1介導(dǎo)的黑色素瘤細(xì)胞黏附于小鼠的血管內(nèi)皮細(xì)胞的效率被認(rèn)為與這些癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能有關(guān)［9］。而這種黏附效率是建立腫瘤轉(zhuǎn)移最關(guān)鍵的因素之一。本研究采用部分肝蒂阻斷法誘導(dǎo)70%肝臟出現(xiàn)缺血再灌注損傷，后經(jīng)門靜脈注射H22肝癌細(xì)胞后不同時(shí)間段，觀察缺血再灌注損傷對肝癌細(xì)胞門靜脈轉(zhuǎn)移的影響，同時(shí)在再灌注2和8 h檢測各組缺血肝組織的肝酶、VCAM-1表達(dá)情況及組織病理學(xué)檢查，為臨床進(jìn)一步探討肝臟血流阻斷對腫瘤門靜脈轉(zhuǎn)移的影響及改進(jìn)手術(shù)方式提供初步的理論基礎(chǔ)。

材料和方法

材料 H22-H8D8肝癌細(xì)胞株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院細(xì)胞中心，VCAM-1為Santa Crus(USA)產(chǎn)品，免疫組織化學(xué)染色試劑盒Histostain-Plus Rabbit Primary購自Invitrogen公司 (USA)。

肝臟缺血再灌注并肝癌門靜脈轉(zhuǎn)移模型的制作 120

只6～7周齡雄性Balb/C小鼠 (25～30 g)，購自中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，水合氯醛300 mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，參照van der Bilt等［5］的方法并做適當(dāng)改進(jìn)，建立小鼠肝臟部分缺血再灌注模型:取正中切口，剪開尾狀葉與左肝葉之間的韌帶，顯露左肝和中肝的肝蒂，用無創(chuàng)微血管夾阻斷中肝葉及左肝葉血流，造成70%肝臟缺血，不阻斷右肝及尾狀葉血流，缺血再灌注一定時(shí)間 (30或45 min)后，1 ml針管 (29G針頭)將H22小鼠肝癌細(xì)胞株5×105細(xì)胞 (50μl)注入門靜脈主干后關(guān)腹。

分組 將Balb/C小鼠按照完全隨機(jī)分組的方法分為3組，每組小鼠40只，分別為假手術(shù)組:解剖出供應(yīng)左肝和中肝的肝蒂但不阻斷，60 min后將肝癌細(xì)胞注入門靜脈;缺血30 min組:肝蒂阻斷30 min再灌注30 min后將肝癌細(xì)胞注入門靜脈;缺血45 min組:肝蒂阻斷45 min再灌注30 min后將肝癌細(xì)胞注入門靜脈。各組小鼠分別于再灌注后2 h、8 h、7 d、14 d后處死 (每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別處死10只)。肝葉分別放入10%中性甲醛或液氮中進(jìn)行速凍，貯存于－80℃深低溫冰箱中備測。

肝臟酶學(xué)的檢測 再灌注后2和8 h取各組左肝葉應(yīng)用診斷用酶試劑盒 (北京綠源博德生物科技有限公司)檢測各組肝葉勻漿中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶水平。

HE染色 術(shù)后7 d處死動(dòng)物，標(biāo)本脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色，觀察組織病理學(xué)變化。

免疫組織化學(xué)染色 再灌注后2和8 h，取各組左肝葉 (缺血肝)，采用免疫組織化學(xué)加強(qiáng)型鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化物酶法，檢測肝組織中VCAM-1蛋白的表達(dá)情況。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測VCAM-1 mRNA 再灌注后2和8 h，取各組左肝葉 (缺血肝)，提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，引物設(shè)計(jì)軟件5.0，北京賽百盛公司合成。引物序列如下:βactin(93bp)上游引物:5’-CAGAAGGAGATTACTGCTCTGGCT-3’，下游引物:5’-GGAGCCACCGATCCACACA-3’;VCAM-1(387bp)上游引物:5’-TCGCGGTCTTGGGAGCCTCA-3’，下游引物:5’-CCGTGACCGGCTTCCCAACC-3’。擴(kuò)增在GeneAmp 5700熒光定量PCR儀進(jìn)行，反應(yīng)條件:95.0℃ 10 min，95.0℃ 25 s，55.0℃ 25 s，72.0℃ 50 s，72.0℃ 5 min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，電腦自動(dòng)記錄反應(yīng)管中的熒光信號值，反應(yīng)結(jié)束由PE 5700軟件分析結(jié)果。

肝臟受侵犯面積測定 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，肝臟轉(zhuǎn)移灶形式各異，單純用腫瘤的數(shù)目或體積很難對腫瘤負(fù)荷情況進(jìn)行準(zhǔn)確的評估，故采用肝臟受侵犯面積 (hepatic replacement area，HRA)作為肝臟腫瘤負(fù)荷的評價(jià)指標(biāo)［5］。隨機(jī)選取各組HE切片，在低倍顯微鏡下計(jì)算該視野下腫瘤所侵犯的面積占視野中肝臟面積的百分比。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad.Prism.v5.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以珋x±s表示，兩組之間比較采用獨(dú)立樣本非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan-Meier法，兩個(gè)變量之間相關(guān)性用Spearman非參數(shù)相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

缺血再灌注對肝功能的影響 肝臟缺血再灌注2 h后，缺血45 min組和缺血30 min組的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶水平顯著高于假手術(shù)組 (P均＜0.05)，且缺血45 min組較缺血30 min組谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶水平變化更加明顯 (P均＜0.05)。假手術(shù)組術(shù)后谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶均一過性輕度升高，缺血45 min組和缺血30 min組谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶水平在8 h表達(dá)均較2 h時(shí)高 (P均＜0.05)(圖1)。

缺血再灌注對荷瘤小鼠生存時(shí)間的影響 缺血30 min組中2/10小鼠在術(shù)后14 d存活，假手術(shù)組中6/10小鼠術(shù)后14 d存活。中位生存時(shí)間:假手術(shù)組16.3 d，缺血30 min組12.1 d，缺血45 min組9.6 d，假手術(shù)組與缺血30 min組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.041)，缺血30 min組與缺血45 min組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.055)(圖2)。

圖1 不同處理方式對肝功能的影響Fig 1 Influence of different treatment modes on the liver function

缺血再灌注對小鼠肝癌細(xì)胞門靜脈侵襲轉(zhuǎn)移的影響 大體標(biāo)本觀察顯示缺血30 min組術(shù)后14 d幾乎均存在肝臟轉(zhuǎn)移 (9/10)，肝臟普遍增大，腫瘤面積較假手術(shù)組大，多數(shù)呈結(jié)節(jié)型，灰白色，質(zhì)硬、脆，浸潤性或膨脹性生長;假手術(shù)組3/10存在肝腫瘤轉(zhuǎn)移，肝葉較缺血30 min組小，腫瘤面積較小，多成點(diǎn)狀或小結(jié)節(jié)狀。組織學(xué)檢查顯示肝細(xì)胞壞死存在于幾乎所有荷瘤小鼠的肝葉中，假手術(shù)組為點(diǎn)狀或小片狀壞死占整個(gè)肝面積的5%～7%，缺血30 min組壞死灶多為團(tuán)狀或大片狀，占整個(gè)肝面積的15%～25%，壞死灶通常出現(xiàn)在腫瘤周圍伴較多的炎癥細(xì)胞浸潤 (圖3)。假手術(shù)組左肝葉的HRA較缺血30 min組顯著減少 (P=0.032)，但假手術(shù)組右肝葉的HRA與缺血30 min組右肝葉比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.089);缺血45 min組左肝葉的腫瘤負(fù)荷較缺血30 min組和假手術(shù)組高 (P=0.013，P=0.007)(圖4)。

缺血再灌注時(shí)間對小鼠肝癌細(xì)胞門靜脈侵襲轉(zhuǎn)移的影響 缺血45 min組中位生存時(shí)間9.6 d與缺血30 min組12.1 d比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.055)，僅有1只小鼠生存期超過14 d(圖2);HE染色顯示缺血45 min組的肝葉被侵犯面積最多 (29.7±13.3)%，壞死面積更大 (25% ～35%)(圖3)。

缺血再灌注對肝組織VCAM-1表達(dá)的影響 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，胞膜和胞漿呈黃褐色為VCAM-1陽性細(xì)胞，主要見于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、少部分白細(xì)胞和肝細(xì)胞 (圖5)。缺血45 min組VCAM-1蛋白水平在再灌注8 h時(shí)明顯高于缺血30 min組和假手術(shù)組(P均＜0.05)(圖6)。對VCAM-1蛋白和HRA進(jìn)行Spearman分析顯示兩者呈正相關(guān) (r=0.491，P=0.045)。再灌注8 h時(shí)，缺血30 min組中VCAM-1 mRNA的表達(dá)水平是假手術(shù)組的4倍以上，缺血45 min組在再灌注2和8 h時(shí)，VCAM-1的表達(dá)水平均明顯高于缺血30 min組和假手術(shù)組 (P均＜0.05)(圖7)。

圖2 不同處理組小鼠生存時(shí)間比較Fig 2 Survival time in different groups

圖3 不同處理方式對小鼠肝癌門靜脈轉(zhuǎn)移的影響 (術(shù)后第7天)(HE染色，×100)Fig 3 Tumor growth and metastasis on the portal vein metastasis in mice with different treatment modes(7 days after operation)(HE×100)

圖4 術(shù)后7 d各組HRA比較Fig 4 HRA on different groups 7 d after operation

圖5 不同處理組再灌注8 h時(shí)，VCAM-1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 (×200)Fig 5 VCAM-1 immunostaining 8 hours after hepatic ischemia/reperfusion with different treatment modes(×200)

圖6 不同處理方式在術(shù)后8 h對各組VCAM-1陽性細(xì)胞數(shù)定量分析結(jié)果Fig 6 Quantitative analysis on the VCAM-1-positive cells in different groups by different treatment modes 8 h after operation

圖7 不同處理方式在術(shù)后2、8 h各組小鼠VCAM-1 mRNA表達(dá)情況Fig 7 VCAM-1 mRNA expression in different groups by different treatment modes 2 and 8 hours after operation

討 論

近年來，雖然各種新的治療肝癌的手段不斷涌現(xiàn)，肝切除術(shù)仍然在根治性肝癌局部治療方法中占據(jù)主導(dǎo)地位［1-2］。然而目前肝癌術(shù)后5年內(nèi)復(fù)發(fā)率達(dá)50% ～60%［2］，肝癌切除術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是目前導(dǎo)致肝癌患者術(shù)后死亡的主要因素［1］。肝癌切除不徹底、術(shù)后殘留腫瘤繼續(xù)生長，是肝癌早期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的最直接原因。但臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)很多實(shí)現(xiàn)根治性切除的肝癌患者術(shù)后大多會(huì)發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，提示存在其他因素誘導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。

本研究證實(shí)肝臟缺血再灌注能夠促進(jìn)H22細(xì)胞肝臟門靜脈轉(zhuǎn)移。首先缺血30 min組腫瘤侵犯面積遠(yuǎn)較假手術(shù)組多，缺血45 min組與缺血30 min組在腫瘤負(fù)荷方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即缺血再灌注能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞門靜脈轉(zhuǎn)移且與缺血時(shí)間呈正相關(guān);其次研究顯示腫瘤一般最先出現(xiàn)在缺血肝葉臟面的邊緣處，后期遍布整個(gè)肝臟。筆者認(rèn)為這是由于缺血肝葉邊緣處相對于肝臟其他部位對缺血再灌注更為敏感的緣故，還可能因該處微血管管徑細(xì)小，由于機(jī)械原因腫瘤細(xì)胞在此處滯留時(shí)間較長。另外本研究顯示缺血組的右肝 (非缺血肝葉)和假手術(shù)組的右肝相比，腫瘤負(fù)荷差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與van der Bilt等［8］研究結(jié)果不一致，van der Bilt等［8］將RCH-H4結(jié)腸癌細(xì)胞注射入大鼠脾實(shí)質(zhì)，3 d后進(jìn)行缺血再灌注，結(jié)果顯示缺血組的非缺血肝葉較假手術(shù)組的肝葉腫瘤門靜脈轉(zhuǎn)移率高，他們認(rèn)為可能與肝缺血再灌注產(chǎn)生的某些誘導(dǎo)因子被釋放入血，到達(dá)非缺血肝葉，加速了腫瘤轉(zhuǎn)移，而本研究結(jié)果提示肝臟缺血再灌注對于循環(huán)中腫瘤細(xì)胞的跨膜轉(zhuǎn)移內(nèi)在機(jī)制局限于缺血組織的局部與系統(tǒng)釋放因子無關(guān)。這種差異筆者認(rèn)為可能與選擇的模型及動(dòng)物品種的不同有關(guān)。

VCAM-1是一種細(xì)胞表面跨膜糖蛋白，在內(nèi)皮細(xì)胞等多種類型細(xì)胞表面表達(dá)，主要介導(dǎo)異型細(xì)胞黏附等作用［9］。本研究在基因和蛋白兩個(gè)水平上檢測VCAM-1隨肝臟缺血時(shí)間的變化情況。VCAM-1的表達(dá)活性在再灌注2 h時(shí)開始升高，到8 h達(dá)到高峰，缺血時(shí)間越長，VCAM-1表達(dá)量越高，對VCAM-1蛋白和HRA進(jìn)行Spearman分析，提示兩者存在正相關(guān)。肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞等受缺血再灌注刺激后上調(diào)VCAM-1表達(dá)，能夠增加腫瘤細(xì)胞在肝竇和血管內(nèi)皮細(xì)胞表面滾動(dòng)時(shí)的黏附，引起內(nèi)皮細(xì)胞回縮，暴露細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)跨膜轉(zhuǎn)移［9］。VCAM-1隨缺血時(shí)間延長而表達(dá)升高，部分解釋了缺血再灌注能夠促進(jìn)腫瘤門靜脈轉(zhuǎn)移的原因。

綜上，本研究證實(shí)肝臟缺血再灌注可以促進(jìn)小鼠腫瘤細(xì)胞門靜脈轉(zhuǎn)移的發(fā)生。VCAM-1表達(dá)升高與腫瘤細(xì)胞門靜脈轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。因?yàn)檗D(zhuǎn)移的腫瘤負(fù)荷和VCAM-1的表達(dá)隨缺血時(shí)間的延長而增高，故縮短肝門阻斷時(shí)間可能有利于減少肝外科手術(shù)中腫瘤的門靜脈轉(zhuǎn)移。

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