楊 娜，王琳琳，袁 悅，葉榮偉，任愛國

北京大學(xué)生育健康研究所 衛(wèi)生部生育健康重點實驗室 北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)系，北京100191

盡管有研究顯示圍產(chǎn)期補充葉酸可以減少神經(jīng)管畸形的發(fā)生率［1-2］，但大多數(shù)新生兒神經(jīng)管畸形患兒的母親在孕期并未出現(xiàn)血葉酸缺乏［3-4］。葉酸受體是介導(dǎo)葉酸進入細胞的重要轉(zhuǎn)運體，在母體胎兒葉酸傳遞過程中發(fā)揮重要作用。2004年，Rothenberg等［5］報道人體內(nèi)的葉酸受體自身抗體與神經(jīng)管畸形有關(guān)。此后，多項研究顯示葉酸受體抗體可能與唇腭裂、孤獨癥、腦葉酸缺乏綜合征等相關(guān)［6-8］，尚需要大樣本量流行病學(xué)研究證實這種相關(guān)性。在進行人群研究時，需要一種可靠、高通量的葉酸受體自身抗體檢測方法。目前，葉酸受體抗體的檢測方法有放射性同位素標記法和酶聯(lián)免疫吸附試驗 (enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。放射性同位素標記法的操作復(fù)雜［5］，不適合大樣本研究。目前，在ELISA檢測葉酸受體自身抗體時，商品化的包被蛋白只有牛源葉酸結(jié)合蛋白，如何獲得高純度的人葉酸受體蛋白是關(guān)鍵。本課題組已經(jīng)成功建立了從健康人胎盤中提取并純化葉酸受體蛋白的方法［9］。本研究旨在建立ELISA檢測血漿中葉酸受體自身抗體IgM的方法，并對該方法的靈敏度、精密度和穩(wěn)定性進行評價。

材料和方法

葉酸受體包被 人葉酸受體的提取及純化方法參見文獻 ［9］。用PBS緩沖液 (pH 7.4)稀釋從胎盤中提取的葉酸受體蛋白至5 ng/μl，4 μl/孔包被96孔酶標板，4℃過夜。含有Tween-20的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液 (tris buffered saline with tween-20，TNT)(pH 7.6，1 mol/L Tris，5 mol/L Nacl，Tween-20 0.5 ml，用雙蒸水定容至1 L)洗板后，每孔加入100 μl 5%的牛血清白蛋白，孵育30 min封閉非特異位點。

標準品或樣品處理 標準品或樣品血漿均按1∶1比例加入活性炭，除去葉酸。目前，尚無商品化的檢測葉酸受體抗體的標準品。研究顯示隨著年齡增長，血液中會出現(xiàn)某些自身抗體 (包括葉酸受體自身抗體)，并且抗體含量也會隨著年齡增長變化［10］。本研究采用的葉酸受體自身抗體標準品為山西省昔陽婦幼保健院采集的健康人EDTA抗凝血漿，用TNT緩沖液稀釋后葉酸受體抗體 IgM濃度分別為6.25×10－4、1.25 × 10－3、2.50 × 10－3、5.00 × 10－3、1.00 × 10－2、2.00×10－2、4.00 ×10－2和8.00 ×10－2，將原始混合血漿中葉酸受體抗體IgM濃度設(shè)定為1。陰性對照為TNT緩沖液。根據(jù)來源選擇樣品 (山西省昔陽婦幼保健院)的合適稀釋倍數(shù)，通常用TNT緩沖液稀釋80～320倍。按50 μl/孔將標準品和樣品加入酶標板。標準品每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，每個樣品設(shè)兩個復(fù)孔，室溫下孵育18 h。

辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgM結(jié)合 用TNT緩沖液沖洗未結(jié)合的標準品或樣品，加入1∶10 000倍稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgM(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，室溫孵育1 h。

樣品檢測 用TNT緩沖液和三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液 (pH 7.6，1 mol/L Tris，5 mol/L Nacl，用雙蒸水定容至1 L)先后洗板，加Femto底物 (SuperSignal ELISA Femto，Thermo Scientific Pierce，美國)顯色，在Synergy2多功能酶標儀 (美國Biotek公司)上檢測各孔發(fā)光信號值。

數(shù)據(jù)分析 以標準品葉酸受體抗體IgM濃度的自然對數(shù)值為自變量，以發(fā)光信號值為因變量，做標準曲線，采用二次多項式擬合，得到血漿葉酸受體抗體IgM濃度的擬合方程。根據(jù)樣品信號值在標準曲線上的位置得出樣品中葉酸受體抗體IgM濃度。

檢測限分析 以空白濃度測量值加3倍標準差表示在適當?shù)闹眯潘絻?nèi)能從樣品中檢出的待測組分的最小量［11］。

精密度分析 用批內(nèi)差異與批間差異表示該方法檢測血漿葉酸受體抗體IgM濃度的精密度，方法參照文獻 ［12-13］。對高、中、低3個不同濃度的血漿樣本連續(xù)檢測3批，每批每個樣本設(shè)8個平行樣本。

穩(wěn)定性分析 對高、中、低3個不同濃度的血漿樣本分別按1∶80、1∶160、1∶320稀釋，測定樣品的葉酸受體抗體IgM濃度。每個稀釋倍數(shù)設(shè)3個平行樣本。

不同包被蛋白對檢測結(jié)果的影響 分別采用人葉酸受體和牛源葉酸結(jié)合蛋白作為包被蛋白，檢測山西省昔陽婦幼保健院收集的24例健康新生兒母親和20例神經(jīng)管畸形患兒母親的血漿標本，比較兩種不同包被蛋白對ELISA檢測血漿葉酸受體抗體IgM濃度的影響。

統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標準差表示，計量資料均數(shù)比較用配對t檢驗，計量資料相關(guān)分析用Pearson相關(guān)。取雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 ELISA方法檢測血漿葉酸受體抗體IgM濃度的標準曲線Fig 1 Standard curve for measuring the concentration of human IgM autoantibody to folate receptor

結(jié) 果

工作曲線 血漿葉酸受體抗體IgM濃度的擬合方程為y=1 680.2x2+27 858x+116 518，R2=0.9958。該工作曲線可測定的血漿葉酸受體抗體IgM濃度范圍為6.25×10－4～8×10－2(標準品濃度為1)(圖1)。

檢測限 該方法能檢測到的血漿葉酸受體抗體IgM濃度的最小量為3.12×10－4。

精密度 該方法檢測高、中和低濃度血清葉酸受體自身抗體IgM的批內(nèi)差異分別為6.61%、3.50%和5.12%(表1)。該方法檢測的高、中和低濃度血清葉酸受體自身抗體IgM的濃度分別為2.13±0.10、0.90±0.05和0.50±0.03，批間差異分別為4.54%、5.49%和5.44%。

穩(wěn)定性 采用此方法檢測高、中、低濃度樣本中葉酸受體自身抗體IgM的濃度，采用不同稀釋倍數(shù)時測定值均較穩(wěn)定。對于高濃度樣本，稀釋倍數(shù)為1∶80、1∶160、1∶320時測定值分別為1.88、1.77、1.97，在均數(shù)±10%范圍內(nèi) (1.69～2.06);對于中濃度樣本，稀釋倍數(shù)為 1∶80、1∶160、1∶320時測定值分別為0.89、0.99、0.81，在均數(shù) ±10%范圍內(nèi) (0.81～0.98);低濃度樣本80倍稀釋時，3次測定值分別為0.46、0.52、0.49，在均數(shù)±10%范圍內(nèi) (0.40～0.49)。稀釋倍數(shù)對高、中、低濃度樣本測量結(jié)果影響均較小。

包被蛋白對檢測結(jié)果的影響 采用人葉酸受體包被檢測板測得的健康新生兒母親葉酸受體抗體IgM濃度為1.43±0.31，顯著高于牛源葉酸結(jié)合蛋白包被檢測板的測定值1.18±0.28(t=－11.9，P＜0.001)，前者的結(jié)果比后者高21%。人葉酸受體包被檢測板測得的神經(jīng)管畸形患兒母親的IgM濃度為5.43±1.82，顯著高于牛源葉酸結(jié)合蛋白包被檢測板的測定值3.21±0.91(t=7.35，P＜0.001)，前者的結(jié)果比后者高69%。Pearson相關(guān)分析顯示:不論對健康新生兒母親還是神經(jīng)管畸形患兒母親，兩種方法檢測的血漿葉酸受體抗體IgM結(jié)果均相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.944(P＜0.001)和0.779(P＜0.001)。

討 論

本研究以人葉酸受體蛋白作為包被蛋白，成功建立了人血漿葉酸受體抗體IgM濃度的ELISA檢測方法，該方法具有靈敏度高、精密度好、結(jié)果穩(wěn)定的優(yōu)點。此外，本研究還對ELISA檢測人血漿葉酸受體自身抗體IgM濃度的方法進行了系統(tǒng)評價。本研究采用的發(fā)光底物Femto，靶蛋白的檢測水平能達到飛克級，并且檢測不同稀釋倍數(shù)樣品中靶蛋白濃度的測定值穩(wěn)定，因此該方法的檢測靈敏度高。此外，此方法檢測高、中、低3種不同濃度血漿葉酸受體抗體IgM濃度的批間和批內(nèi)差異均低于10%，對不同稀釋倍數(shù)同一樣本的測定結(jié)果的波動均在可接受范圍內(nèi)，表明該方法有較高的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。此方法采用化學(xué)發(fā)光法，與同位素標記法相比，具有操作簡單、試劑容易獲得、無放射性污染的優(yōu)點。此外，F(xiàn)emto底物達到最大信號的孵育時間僅為1 min，適合高通量檢測。因此，此方法適合實驗室大樣本量檢測。

本研究分別采用人源葉酸受體蛋白和牛源葉酸結(jié)合蛋白包被檢測板，檢測人血漿葉酸受體自身抗體含量，兩種方法的檢測結(jié)果間有較好的相關(guān)性。牛源葉酸結(jié)合蛋白與人葉酸受體蛋白有80%的同源性，可以解釋檢測結(jié)果的高相關(guān)性。本研究用此方法分別檢測健康新生兒母親和神經(jīng)管畸形患兒母親的血漿葉酸受體自身抗體IgM濃度，健康新生兒母親血漿葉酸受體自身抗體IgM水平低，神經(jīng)管畸形患兒母親血漿葉酸受體自身抗體IgM水平高。結(jié)果顯示人源葉酸受體蛋白包板方法得到的測定值高于牛源葉酸結(jié)合蛋白包板方法，分別高出21%和69%，提示人源葉酸受體蛋白檢測葉酸受體抗體IgM更靈敏，更能反映人血漿樣本中葉酸受體自身抗體IgM的真實水平，如果用牛源葉酸結(jié)合蛋白包被檢測板可能會影響檢測結(jié)果。

本研究采用實驗室制備的混合血漿作為標準品，這是現(xiàn)階段的最佳選擇，目前尚無商業(yè)化的葉酸受體抗體標準品。本研究嘗試尋找更合適的葉酸受體抗體標準品，如來源于人類血清的IgM(#18260，美國Sigma公司)，由于此抗體為人混合血清，存在不同批次間差異的問題，所以相對于實驗室制備的混合血漿，沒有明顯優(yōu)勢;胎盤葉酸受體蛋白2抗體 (#bs-9595R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，由于此抗體僅有兔源產(chǎn)品，因此不適用于本研究。綜合經(jīng)費以及質(zhì)量控制等因素，本研究選擇實驗室制備的混合血漿作為標準品。

由于現(xiàn)階段缺乏制備葉酸受體抗體純品的技術(shù)，所以不能對葉酸受體抗體進行絕對定量，但是對葉酸受體抗體的研究剛剛起步，相對定量值可以滿足目前本領(lǐng)域研究的需要，即進行葉酸受體抗體與某些疾病如出生缺陷的關(guān)聯(lián)研究，將病例組與對照組進行組間相對比較，尋求病因關(guān)系。

本研究的推廣可以促進標準品的研發(fā)，本研究建立了一種目前可以實現(xiàn)的檢測血漿葉酸受體抗體的方法，旨在讓同領(lǐng)域研究者在此基礎(chǔ)上，研究葉酸受體抗體與相關(guān)疾病的關(guān)系。如果有重要意義的研究發(fā)現(xiàn)，如葉酸受體抗體與某些疾病 (如出生缺陷)有關(guān)聯(lián)，可以促進研究者進行葉酸受體抗體純品制備技術(shù)的開發(fā)。

［1］ Vitamin Study Research Group MRC.Prevention of neural tube defects:results of the Medical Research Council Vitamin Study ［J］．Lancet，1991，338(8760):131-137.

［2］ Berry RJ，Li Z，Erickson JD，et al.Prevention of neuraltube defects with folic acid in China ［J］．N Engl J Med，1999，341(20):1485-1490.

［3］ Kirke PN，Molloy AM，Daly LE，et al.Maternal plasma folate and vitamin B12 are independent risk factors for neural tube defects［J］．Q J Med，1993，86(11):703-708.

［4］ Yates J，F(xiàn)erguson M，Shenkin A，et al.Is disordered folate metabolism the basis for the genetic predisposition to neural tube defects?［J］．Clin Genetics，1987，31(5):279-287.

［5］ Rothenberg SP，Da CMP，Sequeira JM，et al.Autoantibodies against folate receptors in women with a pregnancy complicated by a neural-tube defect［J］．N Engl J Med，2004，350(2):134-142.

［6］ Ramaekers VT，Rothenberg SP，Sequeira JM，et al.Autoantibodies to folate receptors in the cerebral folate deficiency syndrome ［J］．N Engl J Med，2005，352(19):1985-1991.

［7］ Bliek JB，Rothenberg SP，Steegers RP.Maternal folate receptor autoantibodies and cleft lip and/or palate［J］．Int J Gynaecol Obstet，2006，93(2):142-143.

［8］ Ramaekers VT，Blau N，Sequeira JM，et al.Folate receptor autoimmunity and cerebral folate deficiency in low-functioning autism with neurological deficits ［J］．Neuropediatrics，2007，38(6):276-281.

［9］ 王琳琳，袁悅，任愛國.人胎盤葉酸受體蛋白的提取、純化及鑒定 ［J］．中國生育健康雜志，2014，25(1):97-100.

［10］ Goronzy JJ，Weyand CM.Immune aging and autoimmunity［J］．Cell Mol Life Sci，2012，69(10):1615-1623.

［11］ Tam C，Mckenna K，Goh Yi，et al.Periconceptional folic acid supplementation:a new indication for the therapeutic drug monitoring ［J］．Ther Drug Monit，2009，31(3):319-326.

［12］ 王玉蘭，吳建民.臨床免疫學(xué)與檢驗［M］．北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:279.

［13］ 徐文婕，曲全岡，劉建蒙.微生物法檢測血漿葉酸實驗方法評價及應(yīng)用［J］．中國衛(wèi)生檢驗雜志，2011，21(7):1722-1724.