黃月紅， 郭杞蘭， 陳治新， 陳運新， 張莉娟， 王小眾

(福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院消化內科，福建 福州 350001)

肝竇是肝細胞與血漿之間進行物質交換的場所。 肝竇壁由肝竇內皮細胞(liver sinusoidal endothe-lial cells, LSECs)組成。生理狀態(tài)下LSECs遠側胞質有許多窗孔，呈篩狀形態(tài),內皮下無基底膜(basement membrane, BM)[1]。病理狀態(tài)下，LSECs的窗孔減少或消失(失窗孔)，內皮下 BM形成，形似連續(xù)毛細血管，稱為肝竇毛細血管化[2]。肝竇毛細血管化是肝纖維化過程中一個重要的病理改變[3]。研究肝竇毛細血管化的形成過程以及其與肝纖維化、肝硬化的發(fā)生關系已經成為肝病研究領域的一個熱點。本實驗擬通過觀察LSECs 與肝竇BM在四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl4)誘導形成大鼠肝纖維化早期的變化，探討四氯化碳誘導大鼠早期肝纖維化時肝竇毛細血管化的形成過程,為進一步抗肝纖維化研究提供實驗依據。

材 料 和 方 法

1 動物和材料

清潔級雄性SD大鼠38只，體重(180±20) g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司[許可證號碼為SCXK(滬)2007-0005]，清潔級條件喂養(yǎng)，自由進食進水。動物實驗遵照福建醫(yī)科大學倫理委員會實驗動物管理條例執(zhí)行，并接受倫理委員會的監(jiān)督和指導。

CCl4和蓖麻油購自上海凌峰化學試劑有限公司，兔抗大鼠CD31 多克隆抗體購自圣克魯斯生物技術(上海)有限公司，兔抗大鼠層黏連蛋白(laminin, LN)及IV型膠原(collagen type IV, Col IV)多克隆抗體購自Abcam，枸櫞酸鹽組織抗原修復液(pH 6.0)、胃蛋白酶消化液、兔超敏二步法免疫組化檢測試劑及濃縮型DAB試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

2 方法

2.1大鼠肝纖維化模型建立[4]及實驗分組 清潔級雄性SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，苦味酸標記，稱體重，平均體重(200±10) g，采用隨機數字表法將大鼠隨機分為2組：正常對照組(N組，6只)，肝纖維化模型組(M組，32只)。M組大鼠腹腔注射50% CCl4蓖麻油混合液，N組大鼠腹腔注射生理鹽水2 mL/kg，每周2次，共4周，分別于造模第3天、第1周、第2周和第4周，將各組大鼠用10%水合氯醛(4 mL/kg)腹腔注射麻醉(禁食8 h)后，收集各組大鼠肝組織保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2HE染色觀察肝組織病理學改變 收集各組大鼠左葉肝組織，經4%甲醛固定、石蠟包埋，切片常規(guī)脫蠟至水，入蘇木素液染色5 min，自來水沖洗，鹽酸乙醇分化30 s，自來水浸泡15 min或溫水(約50 ℃)5 min，置伊紅液染色2 min，蒸餾水沖洗，常規(guī)脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察各組大鼠肝臟組織的炎癥及纖維化程度。

2.3Masson染色法觀察肝組織中網狀纖維的沉積情況 各組大鼠肝組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，Harris蘇木素液染色1～2 min，蒸餾水洗3次，麗春紅品紅液染色5～10 min，蒸餾水洗3次，磷鉬酸分化1 min至膠原纖維淡紅色，入淺綠液染色，使膠原纖維呈綠色約5～10 min，95%乙醇、無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察各組大鼠肝臟組織的網狀纖維沉積情況。

2.4透射電子顯微鏡觀察肝竇內皮細胞及基底膜的改變 取肝左葉部分組織，用鋒利的刀片切成1 mm×1 mm×1 mm, 迅速放入固定液(3%戊二醛-1.5%多聚甲醛)中，4 ℃固定2 h以上，用0.1 mol/L PBS (pH 7.2) 漂洗3次，再用含1%鋨酸和1.5%亞鐵氰化鉀的固定液4 ℃后固定1.5 h，再次漂洗3次，脫水，純618包埋劑35 ℃ 包埋3 h，切片、染色： 超薄切片機切70～80 nm的超薄切片；經醋酸鈾、檸檬酸鉛分別染色5 min，后蒸餾水水洗。在PHILIPS EM208型透射電鏡下觀察肝竇內皮細胞及基底膜的改變并攝片。

2.5免疫組織化學法檢測大鼠肝組織中CD31、LN與Col IV的表達 采用北京中杉金橋生物技術有限公司超敏SP免疫組化試劑盒進行檢測。切片常規(guī)脫蠟、水化，枸櫞酸鹽微波或胰蛋白酶抗原修復，3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶，Ⅰ抗分別為兔抗大鼠CD31多抗(1∶100)、兔抗大鼠LN多抗(1∶100)和兔抗大鼠Col IV多抗(1∶200)，再加入Ⅱ抗，DAB顯色，蘇木素染液復染。省略Ⅰ抗和Ⅱ抗作為空白對照，以PBS替換Ⅰ抗，作為陰性對照。細胞漿、核或膜有棕黃色顆粒沉著為陽性染色。染色結果根據染色細胞多少及染色深淺判斷各指標表達情況，使用Image-Pro Plus 5.0軟件檢測各組目的蛋白表達的積分吸光度(IA)。

3 統(tǒng)計學處理

數據以均數標準差(mean±SD)表示，組間差異用SPSS 11.5統(tǒng)計分析，采用方差分析，以P<0.01為差異有統(tǒng)計學意義.

結 果

1 CCl4誘導肝纖維化早期大鼠肝臟組織病理形態(tài)變化

HE及Masson染色結果顯示(圖1)，正常對照組的大鼠肝組織結構清晰，肝小葉結構正常，肝細胞索以肝小葉中央靜脈為中心向四周放射狀整齊排列，肝細胞無變性、壞死，肝竇無擴張，少量膠原纖維在匯管區(qū)和中央靜脈分布, 肝小葉間未見纖維組織增生。CCl4造模3 d后大鼠肝小葉中央靜脈及匯管區(qū)血管周圍可見炎癥細胞浸潤明顯，肝細胞水腫，少數出現點、灶狀壞死，個別甚至出現橋接壞死，肝竇略擴張,膠原纖維分布同正常組；造模1周時血管周圍炎癥細胞浸潤較前減少，仍見少數點、灶狀壞死及橋接壞死，個別大鼠肝臟橋接壞死范圍廣，累及多個小葉，類似重癥肝炎的表現；匯管區(qū)、肝竇擴大，纖維組織開始增生，沿著匯管區(qū)及中央靜脈向外延伸；造模2周，炎癥細胞浸潤較1周時有所減輕，但纖維組織增生明顯；造模第4周時，可見肝細胞脂肪樣變，小葉結構紊亂，纖維條索更加粗大明顯，但大部分尚未相互連接，無完整分界形成。

Figure 1. Pathological changes in the livers (HE and Masson staining, ×200). N：normal control group; M：liver fibrotic model group.

2 CCl4誘導肝纖維化早期大鼠肝竇內皮細胞與基底膜的改變

透射電鏡結果顯示(圖2)，正常對照組的大鼠LSECs扁平，遠側胞質成薄片狀、不連續(xù)，有許多窗孔，內皮下未見BM，Disse間隙內有大量伸入的肝微絨毛，偶有少量膠原纖維，肝星狀細胞(hepatic stellate cells, HSCs)含有大量脂滴,呈靜止狀態(tài)；CCl4造模3 d后大鼠部分LSECs窗孔數目減少、直徑變小，內皮下未見BM;1周和2周時，LSECs窗孔進一步減少甚至消失，內皮下仍未見BM，Disse間隙內肝微絨毛減少，HSCs脂滴變少，粗面內質網增多；4周時，LSECs窗孔減少甚至消失，范圍較2周廣，間隔內見膠原纖維束，局部內皮下可見連續(xù)基底膜。

Figure 2. Fenestration (?) and basement membrane (→) changes of liver sinusoidal endothelial cells in fibrotic rats observed by transmission electron microscopy. N: normal control group; M: liver fibrotic model group.

3 CCl4誘導肝纖維化早期大鼠肝竇內皮細胞表面標志物CD31的表達

SP免疫組織化學染色結果顯示，正常組大鼠肝竇內皮細胞表面標志物CD31陽性染色主要見于中央靜脈及匯管區(qū)血管壁，部分肝竇可見淡染；CCl4模型組大鼠肝竇CD31陽性染色區(qū)域及染色程度隨著造模時間延長逐漸加深。陽性表達強度半定量分析顯示造模第3天及1周時模型組大鼠肝竇CD31陽性表達較正常大鼠明顯增多，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而3 d與1周之間肝竇CD31陽性表達沒有明顯差別(P>0.05)；隨著造模時間延長，肝竇CD31陽性表達強度逐漸增強，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

4 CCl4誘導肝纖維化早期大鼠肝組織Col IV的表達

SP免疫組織化學染色結果顯示，正常組大鼠Col IV陽性染色多位于中央靜脈、匯管區(qū)血管、膽管內皮細胞的基底膜，肝竇壁染色微弱、斷續(xù)；CCl4肝纖維化大鼠肝組織Col IV陽性表達強度隨著纖維化程度的加重而增強，陽性表達范圍從匯管區(qū)纖維沉積部位到肝竇壁均有明顯陽性著色。陽性表達強度半定量分析顯示CCl4誘導肝纖維化早期各時點大鼠Col IV陽性表達較正常對照組明顯增強，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中以CCl4造模2周與4周時，大鼠Col IV陽性表達范圍及強度均顯著增加，與造模1周時比較，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

5 CCl4誘導肝纖維化早期大鼠肝組織LN的表達

SP免疫組織化學染色結果顯示肝纖維化早期大鼠肝組織LN陽性著色分布與Col IV類似，但陽性表達強度較Col IV弱。陽性表達半定量分析結果顯示大鼠LN表達在CCl4造模后陽性表達明顯增強，尤其在造模第4周時LN陽性表達最明顯，與CCl4造模2周比較差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5。

Figure 5. The expression of laminin in the early stage of liver fibrosis (SP immunohistochemistry, ×200). N: normal control group; M: liver fibrotic model group. Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs N; #P<0.05 vs 2 weeks.

討 論

本研究通過CCl4誘導大鼠肝纖維化模型，動態(tài)觀察肝纖維化形成早期肝竇內皮細胞與基底膜的形態(tài)變化過程，實驗結果顯示在肝纖維化早期(CCl4造模4周后)大鼠局部肝臟組織可形成典型肝竇毛細血管化的改變且肝竇壁上LN的沉積是肝竇毛細血管化連續(xù)基底膜形成的關鍵因素。

肝竇毛細血管化是肝纖維化過程中重要的病理改變, 研究提示肝竇毛細血管化先于肝纖維化的形成[5-6]。LSECs失窗孔和內皮下連續(xù)性BM形成是其主要特征。在肝纖維化形成過程中動態(tài)觀察肝竇毛細血管化的形成有利于后續(xù)抗肝竇毛細血管化研究的作用靶點選擇。故本實驗選用經典肝纖維化造模方法CCl4誘導大鼠肝纖維化以觀察肝竇毛細血管化的形成，結果顯示當肝組織以炎癥反應為主時(造模第3天和1周時)LSECs主要表現為窗孔直徑減小與數目的減少，而網狀纖維沉積增多與基底膜的形成密切相關并且在早期肝纖維化形成時(造模第4周時)肝臟局部可見典型的肝竇毛細血管化形成(肝竇可見LSECs窗孔消失及連續(xù)BM)，與國外報道相似[7-8]。

肝竇毛細血管化的特征之一是LSECs表型發(fā)生改變，LSECs表達血管內皮標志物明顯增強[2]。CD31是常見的血管內皮標記物，正常LSECs不表達CD31，但肝纖維化過程中LSECs表達血管內皮標記物CD31逐漸增強[9-10]，有研究顯示新分離的LSECs是胞內表達CD31而培養(yǎng)后則形成表面表達，掃描電鏡觀察通過CD31磁珠分選得到的LSECs 表面末見窗孔[11]，提示CD31的表達與LSECs的窗孔狀態(tài)密切相關。本實驗結果顯示CCl4誘導肝纖維化大鼠肝臟中CD31陽性染色區(qū)域及染色程度與LSECs的窗孔變化密切相關，隨著LSECs窗孔逐漸減少至消失而肝竇內皮CD31的表達逐漸增強并在肝竇局部形成毛細血管化時(造模第4周時)表達最明顯，提示CD31表達增強反映失窗孔或窗孔數目減少的LSECs增多。

肝竇壁上形成連續(xù)的BM是肝竇毛細血管化的另一重要特征。連續(xù)的BM的主要成份是糖蛋白和基底膜膠原，其中以LN和Col IV為主。LN是ECM中的一種大分子非膠原黏蛋白, 能與膠原等結合形成BM結構, 影響細胞的黏附，調節(jié)細胞的生長與分化, 并與肝纖維化發(fā)生及腫瘤的侵襲轉移有關[12]。正常的肝竇壁僅見以新合成的不連續(xù)的Col IV為主，而無LN[13]。免疫組化染色顯示正常大鼠中央靜脈、匯管區(qū)血管、膽管內皮細胞的基底膜，肝竇壁可見微弱、斷續(xù)的Col IV及LN陽性著色。有報道肝纖維化早期，以Col IV為主的功能性基底膜破壞，Col IV變?yōu)檫B續(xù)性，同時開始出現LN，形成毛細血管化[13]，提示肝竇毛細血管化的啟動與Col IV密切相關而肝竇毛細血管化的形成與Col IV與LN相互交聯密切相關。本實驗結果顯示造模第2周時肝組織網狀纖維沉積增多但肝竇內皮下未見連續(xù)的BM，免疫組化顯示此時肝竇壁BM成分以Col IV陽性著色顯著增多為主，提示Col IV是此時肝竇壁BM的主要成分。隨著CCl4損傷的持續(xù)，于造模第4周部分肝組織局部的肝竇內皮下可形成連續(xù)的BM，此時免疫組化顯示肝組織中Col IV沉積持續(xù)增多同時伴隨著糖蛋白LN表達增多，結果提示肝纖維化早期肝臟局部肝竇毛細血管化形成可見連續(xù)的BM是Col IV與LN表達共同作用的結果。

綜上所述，CCl4誘導肝纖維化早期大鼠肝臟局部可形成典型的肝竇毛細血管，其主要表現為肝竇內皮細胞窗孔直徑的減小、窗孔數量的減少以及由Col IV與LN沉積共同構成連續(xù)的基底膜，其中LN的沉積是連續(xù)基底膜形成的必要條件之一，本實驗為進一步的抗肝竇毛細血管化研究提供了重要的實驗參數。

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