李曉燕， 劉金玲， 桂 樂， 朱健華

(南通大學附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，江蘇 南通 226001)

慢性充血性心力衰竭(簡稱慢性心衰,chronic heart failure,CHF)是多數(shù)心血管疾病的終末階段。多年來研究證實交感神經(jīng)活動增強是慢性心衰發(fā)生發(fā)展的重要機制，過度的交感神經(jīng)興奮性增強對心臟本身和心功能均產(chǎn)生不利影響，這是慢性心力衰竭心功能惡化的主要原因。下丘腦室旁核(paraventricular nucleus, PVN)是神經(jīng)內(nèi)分泌活動的重要調(diào)節(jié)中樞，是調(diào)節(jié)細胞外液容量和交感神經(jīng)驅(qū)動的關(guān)鍵腦區(qū)。大量研究發(fā)現(xiàn)存在于腦組織、外周神經(jīng)系統(tǒng)和心肌細胞中，具有高度的鉀離子選擇性、鈣離子高度敏感性和電壓不依賴性的下丘腦室旁核小電導鈣激活鉀通道(small-conductance calcium-activated potassium channels,SK通道)可引起神經(jīng)元的后超極化，對神經(jīng)的興奮節(jié)律和興奮模式起重要調(diào)控作用。體外實驗[1-2]證明阻斷PVN內(nèi)SK通道，PVN頭端延髓腹外側(cè)區(qū)(rostral ventrolateral medulla, RVLM)神經(jīng)興奮性明顯增加，還可調(diào)節(jié)細胞膜的興奮性。在體實驗[3]證明在正常大鼠中阻斷下丘腦室旁核SK通道后，腎交感神經(jīng)興奮性增強以及平均動脈壓升高。目前在心衰發(fā)病過程中SK通道對PVN神經(jīng)元興奮性調(diào)節(jié)尚不清楚，我們推測在心衰發(fā)展過程中，PVN-RVLM神經(jīng)元中SK通道功能降低，可能增加神經(jīng)元的興奮性，進而促進交感神經(jīng)的興奮性增加。為了進一步觀察SK通道在心衰中的作用，本研究制作大鼠慢性心力衰竭模型，構(gòu)建SK2基因過表達載體作用于下丘腦室旁核，觀察SK2的表達，記錄大鼠心率、血壓和腎交感神經(jīng)活性(renal sympathetic nerve activity,RSNA)的變化，探討心衰中SK通道與腎交感神經(jīng)活性的關(guān)系，研究慢性心衰的中樞調(diào)控機制。

材 料 和 方 法

1 材料與動物

SK2 基因過表達的腺病毒載體rKCNN2重組腺病毒穿梭載體pDC316-mCMV-EGFP-rKCNN2(AD-rKCNN2, 1×1013pfu/L)和空白對照重組腺病毒穿梭載體pDC316-mCMV-EGFP(AD-EGFP, 1×1013pfu/L)由百恩維生物公司提供。兔抗SK2Ⅰ抗購自Alomone Lab；羊抗兔Ⅱ抗購自Santa Cruz。RNA抽提試劑盒(RNeasy Mini Kit)購自Qiagen。

8～12周齡、 體重(200±20) g的健康雄性SD大鼠由南通大學實驗動物中心提供。80只大鼠隨機分為4組：假手術(shù)對照組(sham-EGFP)、假手術(shù)SK2過表達組(sham-rKCNN2)、心衰對照組(CHF-EGFP)和心衰SK2過表達組(CHF-rKCNN2)。以結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支制造心衰大鼠模型[4]，假手術(shù)組同樣開胸打開心包, 但僅在相同部位穿線并不結(jié)扎, 術(shù)后肌肉注射2×105U青霉素鈉預防感染, 術(shù)后喂養(yǎng)6周后超聲心動圖檢測心功能變化，采用EF值<42%作為評定心力衰竭的診斷標準[5]。

2 主要方法

2.1下丘腦室旁核腺病毒注射 術(shù)后6周4組大鼠均以10%水合氯醛1.5 mL/kg腹腔注射來實施麻醉，固定在腦立體定位儀上，沿矢狀縫做皮膚切口暴露顱骨，調(diào)整前囟和后囟至同一水平。 PVN位置：B=1.8 mm，L=0.4 mm，H=7.9 mm，B表示為前囟向后，L表示正中線左右旁開，H表示硬腦膜下深度。電鉆顱骨鉆孔，用微量注射器插入PVN內(nèi)，左右兩側(cè)分別注射100 nL AD-rKCNN2或AD-EGFP(由百恩維生物公司通過光鏡觀察對神經(jīng)沒有損傷，轉(zhuǎn)染效果良好)。

2.2AD-rKCNN2 病毒載體過表達效果的驗證

2.2.1免疫組化染色 病毒注射后7 d，每組實驗大鼠隨即抽取5只，麻醉大鼠后, 經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛固定, 取出腦組織經(jīng)12%～18%蔗糖脫水固定。取固定后腦組織，頭尾方向截取視交叉與乳頭體之間部分，在冰凍切片機上進行連續(xù)冠狀切片，切片厚度 15 μm。切片加3% H2O2室溫下孵育以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗3次×5 min，加SK2抗體孵育，PBS沖洗，每張切片加聚合物增強劑(polymer helper)，加抗兔聚合物(poly-HRP anti-mouse/rabbit IgG)，孵育沖洗，加DAB，室溫條件下顯色沖洗，蘇木素復染。脫水，透明，封片。所有切片采用雙盲法由2位有經(jīng)驗的病理科醫(yī)生閱片。隨機觀察5個高倍鏡視野計數(shù)陽性細胞數(shù)。

2.2.2組織提取 病毒注射后7 d，每組實驗大鼠隨即抽取10只，大鼠斷頭，取腦，移至液氮，隨后儲存在-80 ℃的條件下，留作進一步的實驗。實驗時迅速從冰箱中取出冰凍的腦，用冰凍切片機切片。切片厚度：300 μm(60 μm×5)。在冰上操作，用穿孔器，根據(jù)大鼠腦定位圖譜(Watson & Paxinos)，在2 mm厚(距前囟點-0.84 ～-2.8 mm)的雙側(cè)腦片的PVN所在區(qū)域，打孔，提取PVN至Eppendorf 管中。

2.2.3Western blotting 取100～150 mg下丘腦室旁核組織, 加入1 mL RIPA， 10 μL苯甲基磺酰氟勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，以去除細胞碎片，收取上清液分裝后-80 ℃保存?zhèn)溆?。BCA法進行蛋白定量后, 取總蛋白50 μg，與5×上樣緩沖液混合煮沸5 min，10%SDS聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離蛋白。電泳結(jié)束后, 蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉60 min, 加入SK2Ⅰ抗(1∶200)室溫振蕩孵育2 h，加入HRP標記羊抗兔Ⅱ抗(1∶500)孵育1 h。然后, 經(jīng)顯色、曝光、掃描、Quantity One圖像分析軟件進行分析。

2.2.4RT-PCR 取100 mg室旁核組織，置于預冷的勻漿器中，加入1 mL Trizol冰上勻漿，將勻漿液室溫放置10 min后倒入1.5 mL EP管中12 000 r/min、4 ℃離心10 min。取上清，加0.2 mL氯仿，劇烈搖動30 s，室溫3 min。12 000×g、4 ℃離心15 min。 吸上層無色水相轉(zhuǎn)移入另一EP管中(約0.5 mL)。加等體積異丙醇，混勻， 室溫 20 min，12 000×g、4 ℃離心10 min。棄上清，加75%乙醇1 mL，振蕩。12 000×g、4 ℃離心5 min去上清，用濾紙小心吸取殘留液體，室溫干燥5～10 min，加入30～50 μL DEPC水，充分溶解RNA，紫外分光光度計法測定RNA，將RNA溶液置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。按照試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄提取cDNA。按照常規(guī)方法進行RT-PCR實驗。SK2上游引物5’-ACCTGCACGAGATGGACTCA-3’，下游引物5’-TTGTGCTCCGGCTTAGACAC-3’片段大小為145 bp。按照94 ℃×3 min，94 ℃×30 s,-60 ℃×30 s,40個循環(huán)，72 ℃ 10 min。擴增完畢后取5 μL 產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠(含溴化乙啶) 電泳, 攝像，分析。

2.3血壓、心率和腎交感神經(jīng)活性的測定 病毒注射后7 d，每組實驗大鼠隨即抽取5只，2%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔麻醉后, 將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺上, 氣管插管, 分離頸外靜脈并插管，分離左側(cè)股動脈并插管, 導管接壓力換能器, 與橋式放大器相連，PowerLab 8/30 SP系統(tǒng)采集信號，持續(xù)監(jiān)測動脈血壓、平均動脈壓(mean arterial pressure, MAP)和心率；然后動物取俯臥位，利用門齒鉤、雙側(cè)耳棒將大鼠頭部固定于腦立體定向儀上，接著動物取右側(cè)臥位, 經(jīng)腰部縱行切口沿腹膜后路徑暴露左側(cè)腎臟、腎動脈和腎神經(jīng)，分離腎交感神經(jīng)，浸入溫石蠟油中，安放銀絲電極，接生物電放大器，PowerLab 8/30 SP系統(tǒng)采集信號。下丘腦室旁核注射SK2受體阻滯劑apamin(12.5 pmol/100 nL)，記錄心率、血壓和腎交感神經(jīng)活性。腎交感神經(jīng)放電對藥物的反應以注藥前后實測值之差與注藥前相比的百分率表示，其中微量注射前取1 min腎交感神經(jīng)放電的平均值。微量注射后，在達到最大反應后的1 min時間內(nèi)求RSNA反應的平均值。腎交感神經(jīng)放電以實測值與噪聲值之差表示，噪聲值為股靜脈注射10%KCl后10 min的RSNA值。實驗結(jié)束時,室旁核內(nèi)微量注射2%滂胺天藍溶液50 nL, 靜脈注射10% KCl處死動物剪取頭顱,去除顱骨，將腦組織固定于10%甲醛溶液中2 d后切片在顯微鏡下定位微量注射點位置，定位不準確者不列入統(tǒng)計。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件處理,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間差異采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 大鼠心功能評價

左冠脈結(jié)扎術(shù)后6周，超聲檢查可見手術(shù)組大鼠存在不同程度的心尖區(qū)或心前壁變薄，室壁運動減弱，左心內(nèi)徑擴大，射血分數(shù)(ejction fraction,EF)下降。表1顯示了假手術(shù)組與手術(shù)組的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)：CHF組左心室舒張期內(nèi)徑(left ventricular interior dimention,LVIDd)較sham組明顯增高，EF及短軸縮短率(fractional shortening, FS)較sham組明顯降低(P<0.01),差異有統(tǒng)計學意義，見表1。這表明慢性心衰引起心室重構(gòu)和水鈉潴留。

表1 冠脈結(jié)扎術(shù)后6周大鼠心功能測量值的比較

室旁核微量注射AD-rKCNN2后7 d，心衰組左心室舒張期內(nèi)徑、射血分數(shù)和短軸縮短率較注射前有好轉(zhuǎn)，但無統(tǒng)計學意義，見表2。

表2 室旁核微量注射AD-rKCNN2后7 d心功能的測定

2 免疫組化檢測大鼠下丘腦室旁核SK2表達的變化

定位注射腺病毒后7 d，灌注處死大鼠取組織做冰凍切片行免疫組化，觀察大鼠下丘腦室旁核SK2表達變化，發(fā)現(xiàn)SK2陽性細胞表現(xiàn)為細胞漿著棕黃色，心衰對照組(CHF-EGFP)的SK2陽性細胞較少且染色淺，明顯低于假手術(shù)對照組(sham-EGFP)，SK2 過表達組大鼠下丘腦室旁核SK2陽性細胞數(shù)量多且染色深，明顯多于心衰對照組，見圖1。

Figure 1. The expression of SK2 in the PVN (immunohistoche-mical staining,×200). Mean±SD. n=5. #P<0.05 vs sham-EGFP; *P<0.05 vs CHF-EGFP.

3 RT-PCR和Western blotting檢測下丘腦室旁核SK2 轉(zhuǎn)染及表達水平

腺病毒定位注射后 7 d，取大鼠下丘腦室旁核組織，利用 RT-PCR和Western blotting檢測SK2表達，心衰對照組SK2表達明顯低于假手術(shù)對照組，SK2過表達組明顯多于心衰對照組，見圖2。

4 微量注射SK2受體阻滯劑apamin后大鼠血壓、心率和腎交感神經(jīng)活性的比較

表3示SK2阻滯劑apamin注射后，CHF-EGFP組較sham-EGFP組的MAP和RSNA增幅降低(P<0.05)。給予AD-rKCNN2后，CHF-rKCNN2組較CHF-EGFP組MAP和RSNA增幅升高(P<0.05)。Sham-rKCNN2和sham-EGFP組對比RSNA無明顯變化。各組大鼠心率無明顯變化。

討 論

本實驗主要發(fā)現(xiàn)心衰大鼠的SK2表達明顯少于假手術(shù)對照組，PVN微量注射AD-rKCNN2使心衰大鼠增高的腎交感神經(jīng)活性明顯降低，這個結(jié)果顯示下丘腦室旁核SK2在調(diào)節(jié)心衰大鼠腎交感神經(jīng)活性方面起重要作用。

Figure 2. The mRNA (A)and protein (B) expression of neuronal SK2 in the punched paraventricular nucleus (PVN) tissues measured by RT-PCR and Western blotting. Mean±SD. n=5. #P<0.05 vs sham-EGFP; *P<0.05 vs CHF-EGFP.

表3 微量注射SK2受體阻滯劑apamin后大鼠平均動脈壓、心率和腎交感神經(jīng)活性改變的比較

*P<0.05vsCHF-EGFP;#P<0.05vssham-EGFP.

目前認為SK通道至少有3種亞型: SK1(KCNN1)、SK2(KCNN2)和SK3(KCNN3)。在不同的組織細胞上各亞型表達存在差異，在神經(jīng)系統(tǒng)中主要為SK2和SK3亞型通道。SK的3個亞型對蜂毒明肽(apamin)的敏感性不同，其中SK1不能被apamin阻斷，而SK2能被apamin阻斷[6]。我們制作大鼠SK2過表達基因(AD-rKCNN2)用于本實驗。

交感神經(jīng)過度激活是心力衰竭的主要病理特征，也是心力衰竭發(fā)病率和病死率不斷提高的主要原因，PVN是神經(jīng)活動的重要調(diào)節(jié)中樞，是調(diào)節(jié)交感神經(jīng)驅(qū)動的關(guān)鍵腦區(qū)，可以通過改變外周交感神經(jīng)的傳出活動發(fā)揮它對心血管功能的調(diào)節(jié)作用[7-9]。神經(jīng)元興奮性的重要決定因素是動作電位后的后超極化，它影響神經(jīng)元的放電功能。SK通道通過介導神經(jīng)元細胞動作電位的后超極化過程，調(diào)控神經(jīng)元的放電模式[2, 10]。我們的實驗通過RT-PCR 和 Western blotting得出心衰大鼠SK2 mRNA和蛋白表達較假手術(shù)組明顯降低(P<0.05)，給予AD-rKCNN2后，SK2過表達組明顯高于心衰對照組且差異有統(tǒng)計學意義，反映了SK2表達確實在心衰狀態(tài)下較假手術(shù)組減低。該結(jié)果提示心衰時PVN內(nèi)出現(xiàn)了SK通道蛋白的表達變化，SK通道亞型的表達受到抑制。有研究表明SK2過表達會引起后超極化電流顯著增強[11]，轉(zhuǎn)基因小鼠的小腦神經(jīng)核團SK2下調(diào)可能通過使后超極化電流缺失而導致自主性放電及興奮性的增加[12]。因此我們推測SK介導中樞神經(jīng)元放電特性的調(diào)控功能在心衰時也會降低。上述研究證實了SK通道的表達變化可以影響其調(diào)控神經(jīng)元活性的功能。我們的研究表明SK2過表達治療使心衰大鼠增高的腎交感神經(jīng)活性明顯降低，推測其潛在的規(guī)律是心衰SK通道表達減少，則PVN神經(jīng)元自主性放電及興奮性增加，從而促使交感神經(jīng)沖動由中樞向外周組織發(fā)放增加，并加重心衰的發(fā)生。SK通道表達增加，則PVN神經(jīng)元自主性放電及興奮性降低，可能改善心衰的進展。

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