于 楊, 馮玉梅, 郭守東, 崔英杰, 宋國華, 馮 蕾, 羅 甜, 陳 超, 王義維, 蔣憲成, 秦樹存△

(1山東省高校動脈粥樣硬化重點實驗室,泰山醫(yī)學院動脈粥樣硬化研究所,山東 泰安 271000；2承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院,河北 承德 067000； 3紐約州立大學下州醫(yī)學中心解剖學和細胞生物學系，美國 紐約 11203)

心腦血管疾病是現(xiàn)代社會人類的頭號殺手，其主要病理學基礎是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)。高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)是體內最重要的抗AS因素[1]。時至今日，越來越多的研究人員證明HDL的水平與其功能幾乎同等重要，對AS的發(fā)生發(fā)展意義重大[1-2]。HDL顆粒成分中，載脂蛋白、酶類和某些重要脂質分子在內的物質對HDL的抗AS功能至關重要。

生理狀態(tài)下，超過50%的血漿脂質信號分子鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate，S1P)富集于HDL上，并可通過其特異性受體發(fā)揮動脈保護作用[3]。紅細胞、內皮細胞、血小板和肥大細胞等均能釋放S1P入血液循環(huán)[4]。HDL通過S1P特異性載體載脂蛋白M(apolipoprotein M，apoM)將S1P富集[5]。然而，S1P如何從細胞到HDL上的轉運機制目前仍不明確，其分布與血漿蛋白的關系及其機制也有待進一步闡明。

磷脂轉運蛋白(phospholipid transfer protein，PLTP)是一種多功能蛋白，廣泛表達于肝細胞、脂肪細胞及巨噬細胞等。PLTP能介導磷脂、游離膽固醇及其它雙性脂質分子從富含甘油三酯(triglyceride, TG)的脂蛋白顆粒向HDL轉運[6]。在冠心病患者，血漿HDL水平下降同時伴有PLTP活性增高[7]。另外，冠心病及心肌梗塞患者非HDL(non-HDL)上S1P明顯增加，提示血漿脂蛋白上S1P水平及分布與動脈粥樣硬化性疾病嚴重程度關系密切[8]。S1P是鞘氨醇的磷酸化產(chǎn)物，其分子結構特點與其它能夠被PLTP轉運的雙性脂質分子相似，這提示PLTP很有可能具有轉運S1P的作用，并通過該機制改變S1P在HDL和其它脂蛋白上的含量和分布。本研究結果表明，PLTP過表達情況下，能夠顯著降低HDL上S1P的同時升高低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL)上S1P，其機制可能與PLTP介導S1P的轉運有關。

材 料 和 方 法

1 動物

PLTP轉基因小鼠(PLTPtransgenic mouse，PLTP-Tg)和PLTP敲除小鼠(PLTP-/-)由蔣憲成博士贈予。本研究中所用PLTP-Tg、PLTP-/-及野生型(wild-type，WT)小鼠的遺傳背景均為C57BL/6并經(jīng)過9代回交。喂養(yǎng)小鼠的標準飼料購自北京維通利華公司，自由飲水。所有實驗動物均喂養(yǎng)于溫濕度可控、12/12 h亮暗循環(huán)的房間內。本實驗經(jīng)過泰山醫(yī)學院動物關懷委員會認證，所有動物實驗均按照《泰山醫(yī)學院實驗動物關懷與使用指南》進行。

2 抗體和材料

apoM抗體購自Cell Signaling Technology。完全蛋白酶抑制劑混合片劑購自Roche。D-erythro-S1P、離心分離柱 (截流分子量≤3 kD)、分析純甲酸和甲酸銨購自Sigma-Aldrich。內標D-erythro-C17-鞘氨醇-1-磷酸(C17-S1P)購自Avanti Polar Lipids Inc.。甲醇和乙醇購自SK Chemicals。脂質定量試劑盒購自中生北控公司。蛋白定量試劑盒、透析膜(截流分子量≤ 8 kD)和D-Hanks緩沖液購自Solarbio。

3 血漿分離和脂蛋白制備

第10～11周齡時，禁食后取材，分離WT或PLTP-Tg血漿0.6 mL后進行超速離心以分離脂蛋白[9]。

4 S1P相關檢測

4.1制備S1P標準品 S1P標準品濃度為0.1 g/L溶于乙醇后，即分裝，并儲存于-20 ℃。通過稀釋獲得系列工作液濃度為50～1 000 g/L。

4.2生物樣本制備和脂質提取 20 μL血漿樣本與10 μL內標C17-S1P (400 μg/L)與甲醇充分混合后，超聲10 min，11 000×g離心10 min。將上清轉移至玻璃瓶中進行S1P定量檢測。用10 μL內標溶液(400 mg/L)和甲醇校正標準品系列溶液，此刻內標C17-S1P濃度為40 mg/L。

4.3串聯(lián)質譜分析 Waters Symmetry? 碳18柱(3.5 μm, 2.1 mm 內徑×10 mm)色析法線性洗脫(3.5 μm, 2.1 mm 內徑×100 mm) 后，流動相成分為2 mol/L 甲酸銨、0.1%甲酸溶解于90%甲醇。上樣體積為5 μL，流速為0.2 mL/min。采用陽離子模式操作質譜儀器， 離子噴嘴電壓為5 500V，溫度為550 ℃，輔助氣壓力為55 psi。 噴霧氣壓力55 psi, 氣幕壓力10 psi，碰撞氣壓為中等。S1P (碰撞能量29.0 V)離子躍遷產(chǎn)物前體m/z 380.2→264.1，C17-S1P (碰撞能量19.9V) 離子躍遷產(chǎn)物前體 m/z 用于在液質聯(lián)用-串聯(lián)質譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)多反應模式(multiple response model，MRM)下定量，保留時間100 ms。采用Analyst Software 1.6定量分析。通過標準曲線上S1P標準品和內標標準品濃度以及S1P峰面積與內標峰面積比值最終計算出樣本中S1P濃度。

4.4S1P轉運實驗 為明確PLTP轉運S1P的作用，本研究采用一種供體-接受體轉運體系。首先，新鮮分離的PLTP-/-紅細胞(red blood cell, RBC)經(jīng)冰冷的D-Hanks緩沖液重懸后，600×g4 ℃離心5 min, 棄上清。重復洗滌1次以除去殘存血漿。RBC懸液細胞密度調整至1010～1011/L，該溶液作為S1P供體，平均S1P含量為(900.67±6.68) ng/L。參照Yoshino方法制備重組HDL作為S1P接受體。取自PLTP-/-和WT新鮮血漿分別作為轉運實驗的陰性對照或PLTP來源。D-Hanks緩沖液作為轉運實驗的空白對照。20 μL的供體、50 μL接受體和2 μL 含PLTP的WT血漿或PLTP-/-血漿或D-Hanks液在Eppendorf管內輕柔混合，并用D-Hanks液調整體積至100 μL。轉運實驗混合物在37 ℃孵育60 min，孵育后300×g4 ℃離心2 min分離上清HDL和RBC沉淀。分別檢測上清中和沉淀內S1P含量。為明確轉運實驗中S1P以何種形式存在，本研究采用離心分離柱(截流分子量≤ 3 kD)將轉運實驗結束后的上清進行處理。結果表明分子量<3 kD的流出液中并未檢測到S1P。這證明本系統(tǒng)中S1P基本以結合型存在。

5 蛋白分離、電泳及免疫印跡

參照文獻[10]每孔2 μg血漿或脂蛋白樣本加入十二烷基硫酸鈉凝膠中進行電泳和免疫印跡檢測apoM含量，采用Image-Pro Plus 6.0分析。

6 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，2 組間比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 PLTP過表達降低血漿S1P含量

收集PLTP-Tg與WT小鼠血漿后檢測血脂和S1P含量。血漿脂質水平見表1?？梢奝LTP-Tg小鼠血漿總膽固醇(total cholesterol, TC)、HDL膽固醇(HDL cholesterol, HDL-C)和非HDL膽固醇(non-HDL-C)均顯著低于WT小鼠。如圖1A所示，PLTP-Tg小鼠血漿S1P含量顯著低于WT小鼠。由于血漿中超過60%的S1P富集于脂蛋白上，脂蛋白上脂質含量變化可能對血漿S1P產(chǎn)生影響，所以將血漿S1P含量采用TC進行校正。結果表明,經(jīng)過TC校正后，PLTP-Tg小鼠血漿S1P含量顯著高于WT，見圖1B。這說明PLTP對血漿S1P含量和分布有顯著影響。

表1 血漿脂質含量

Figure 1. Plasma S1P content (A) and total cholesterol (TC)-normalized plasma S1P content (B) in PLTP-Tg mice. Mean±SD.n=8.*P<0.05,**P<0.01 vs WT group.

2 PLTP過表達顯著升高LDL上S1P比例

如圖2所示，PLTP-Tg小鼠HDL和極低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein,VLDL)上S1P含量較WT小鼠明顯減少，而LDL上S1P則顯著增加127.4%，提示過表達PLTP很可能促進LDL上S1P含量的增加。

3 PLTP從紅細胞將S1P轉運至重組脂質體

如圖3所示，與不含PLTP的血漿相比，WT血漿能夠增加重組脂質體上S1P含量超過350%，說明PLTP能夠將S1P轉運至重組脂質體。

Figure 2. S1P content in lipoprotein was affected by PLTP overexpression.A～C: S1P content in HDL,LDL and VLDL, respectively; D: S1P distribution. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01 vs WT group.

Figure 3. PLTP transferred S1P from RBC to recombinant liposome.Mean±SD.n=4.**P<0.01 vs blank; △△P<0.01 vs negative control.

4 PLTP過表達不影響血漿apoM含量

如圖4A和B所示，PLTP-Tq與WT小鼠比較，apoM含量無論是血漿中還是HDL組分中均無明顯差別。圖4C顯示,PLTP過表達不影響血漿中和脂蛋白上apoM的含量和分布。

討 論

S1P是HDL上與血管保護作用有關的重要信號分子[5]。在動脈粥樣硬化性疾病時S1P在脂蛋白上分布有明顯變化[8]。為闡明該機制，我們開展如下研究并首次發(fā)現(xiàn)：(1)PLTP過表達能升高經(jīng)膽固醇校正后血漿S1P含量；(2)血漿中高水平PLTP能顯著增加LDL組分中S1P含量；(3)其機制與PLTP能夠介導S1P從細胞向脂蛋白類顆粒轉運這一機制有關；(4)血漿apoM含量與PLTP表達無關。

由于S1P在HDL上和非HDL上表現(xiàn)出相反的作用，提示S1P在HDL與非HDL上的分布變化可能是AS性疾病的重要致病因素。因此明確血漿S1P分布對于研究冠心病和中風等AS性疾病的發(fā)病機制有重要意義。血漿中S1P的主要載體是HDL，HDL-S1P具有增強內皮細胞屏障作用和促進內皮源性一氧化氮分泌等作用，也是HDL動脈保護功能的重要組成部分[5]。因此，血漿S1P的含量和分布對于HDL功能有重要意義。本研究結果表明參與HDL代謝的酶或蛋白能夠改變S1P分布，并參與AS性疾病的發(fā)生發(fā)展。

Figure 4. ApoM content in plasma and lipoprotein was not affec-ted by PLTP overexpression in mice. A: plasma apoM content in PLTP-Tg and WT mice; B: HDL apoM content in PLTP-Tg and WT mice; C: apoM content in non-HDL (combined VLDL and LDL) and HDL from PLTP-Tg or WT mice. Mean±SD.n=3.

PLTP屬于脂質轉運家族并能介導脂蛋白和細胞間雙性分子的轉運[11]。PLTP-Tg小鼠血漿TC和HDL-C顯著下降提示其脂蛋白顆粒上蛋白和脂質含量均發(fā)生明顯變化。PLTP過表達可加重載脂蛋白E敲除鼠AS進程，而PLTP缺乏能減輕多種AS模型的斑塊形成，提示PLTP與AS的發(fā)生發(fā)展有密切關系[6]。然而關于PLTP表達水平對血漿S1P的含量和作用的影響尚無報道。本研究首次發(fā)現(xiàn)PLTP過表達能降低血漿和HDL上S1P的含量，提示PLTP對維持HDL上S1P含量有重要作用。除此之外，本團隊即將發(fā)表的數(shù)據(jù)表明PLTP能夠促進S1P從紅細胞向HDL轉移，在此基礎上，本研究采用重組脂質體作為S1P接受體，進一步證實PLTP有助于S1P從紅細胞向脂質體轉移這一重要作用。

PLTP能夠介導諸如磷脂、維生素E等一些類型的脂質分子以“脂蛋白到脂蛋白”或“細胞到脂蛋白”等形式的轉移[11]。PLTP的結構與功能研究表明其能夠轉運的分子均屬于雙性分子，兩端分別帶有親水和疏水基團。S1P屬于鞘氨醇的磷酸化產(chǎn)物，亦屬于雙性分子，具有與其它能夠被PLTP轉運的分子相似的結構。因此本研究采用紅細胞作為S1P供體，重組脂質體作為S1P接受體，檢測PLTP轉運S1P的作用。該方法采用的轉運緩沖體系與廣泛報道的PLTP活性檢測采用的“供體-接受體”系統(tǒng)相同[7]。本研究發(fā)現(xiàn)PLTP能夠介導S1P自紅細胞向脂質體轉運，這一結果闡明了PLTP過表達通過其直接轉運S1P的作用影響S1P含量和分布。

另一個影響HDL上S1P含量的決定性因素是S1P的內源性特異載體apoM，apoM主要富集于HDL[5, 12]。在LDL受體敲除鼠和apoE敲除鼠體內，apoM可發(fā)生從HDL向非HDL遷移的現(xiàn)象[12]。而本研究結果表明，PLTP過表達不影響小鼠血漿apoM含量，也未造成apoM從HDL上向其它脂蛋白的遷移。這從另一角度證明與其它基因修飾小鼠不同，PLTP過表達升高LDL上S1P含量的機制與向non-HDL上轉運游離S1P有關，而不是通過影響apoM分布產(chǎn)生的間接作用。

LDL除了能通過結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF) -細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinases,ERK) 1/2-c-Jun N末端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNK)途徑反式激活S1P受體外，還具有很強的S1P結合能力，該能力與apoM無關[11-12]。本研究結果表明在非HDL上檢測不到apoM，提示LDL可能通過某種未知機制俘獲S1P。另外，HDL能增加基礎水平上心肌灌流，而S1P則可通過S1P3受體抑制該機制，說明S1P活性與HDL的生物學效應并非始終保持一致，這可能與S1P的受體分布和轉運形式有關[12-13]。心梗及穩(wěn)定性心絞痛等AS性疾病患者非HDL上S1P含量增加提示該現(xiàn)象很可能與上述疾病的發(fā)生發(fā)展關系密切。同時冠心病等患者血漿PLTP活性明顯高于正常人群，那PLTP是否通過影響S1P的分布對AS性疾病產(chǎn)生影響，有待于進一步研究[13]。

綜上所述，本研究進一步明確了PLTP在血漿脂蛋白上S1P分布的作用，其機制與PLTP直接轉運S1P有關。該結果為PLTP參與AS性疾病的病理生理機制提供了新的實驗依據(jù)。

[參 考 文 獻]

[1] Kontush A, Chapman MJ. Functionally defective high-density lipoprotein: a new therapeutic target at the crossroads of dyslipidemia, inflammation, and atherosclerosis[J]. Pharmacol Rev, 2006, 58(3):342-374.

[2] Takuwa Y, Okamoto Y, Yoshioka K, et al. Sphingosine-1-phosphate signaling in physiology and diseases[J]. Biofactors, 2012, 38(5):329-337.

[3] 韋淑萍, 孫慧燕, 劉 未,等. ZNF580在1-磷酸鞘氨醇誘導內皮細胞遷移和增殖中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2012, 28(12): 2119-2124.

[4] Levkau B. Cardiovascular effects of sphingosine-1-phosphate (S1P)[J]. Handb Exp Pharmacol, 2013, 216(6):147-170.

[5] Christoffersen C, Obinata H, Kumaraswamy SB, et al. Endothelium-protective sphingosine-1-phosphate provided by HDL-associated apolipoprotein M[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011, 108(23):9613-9618.

[6] Jiang XC, Qin S, Qiao C, et al. Apolipoprotein B secretion and atherosclerosis are decreased in mice with phospholipid-transfer protein deficiency[J]. Nat Med, 2001, 7(7):847-852.

[7] Attia N, Nakbi A, Smaoui M, et al. Increased phospholipid transfer protein activity associated with the impaired cellular cholesterol efflux in type 2 diabetic subjects with coronary artery disease[J]. Tohoku J Exp Med, 2007, 213(2):129-137.

[8] Sattler KJ, Elbasan S, Keul P, et al. Sphingosine 1-phosphate levels in plasma and HDL are altered in coronary artery disease[J]. Basic Res Cardiol, 2010, 105(6):821-832.

[9] 徐 丹, 孟 宇, 胡 波, 等. 基于HPLC-MS/MS Q-TOF分析糖尿病腎病維持性血透患者含糖透析的代謝特征[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(3): 455-461.

[10] 臧嬋媛, 康 毅, 溫 克, 等. 1-磷酸鞘氨醇對血小板活化因子所致大鼠腸系膜微血管通透性增高的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2010, 26(4): 681-685.

[11] Faber K, Axler O, Dahlback B, et al. Characterization of apoM in normal and genetically modified mice[J]. J Lipid Res, 2004, 45(7):1272-1278.

[12] Oram JF, Wolfbauer G, Tang C, et al. An amphipathic helical region of the N-terminal barrel of phospholipid transfer protein is critical for ABCA1-dependent cholesterol efflux[J]. J Biol Chem, 2008, 283(17):11541-11549.

[13] Robins SJ, Lyass A, Brocia RW, et al. Plasma lipid transfer proteins and cardiovascular disease. The Framingham Heart Study[J]. Atherosclerosis,2013,228(1):230-236.