吳華++++唐群+++++瞿志雄+++++王健++++王興華

[摘要] 目的 探討5-羥色胺和5-羥色胺轉(zhuǎn)運體在青壯年猝死綜合征腦組織的表達及其意義。 方法 運用免疫組織化學(xué)S-P法檢測10例正常腦組織和8例青壯年猝死綜合征腦組織中5-羥色胺和5-羥色胺轉(zhuǎn)運體的表達水平，利用圖像分析技術(shù)測量陽性細胞的平均光密度值。 結(jié)果 青壯年猝死征死者腦干中縫背核5-羥色胺的平均光密度值低于正常腦組織，而5-羥色胺轉(zhuǎn)運體的平均光密度值高于正常腦組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 5-羥色胺及5-羥色胺轉(zhuǎn)運體的變化參與青壯年猝死綜合征的發(fā)病過程，可作為診斷青壯年猝死綜合征的參考指標。

[關(guān)鍵詞] 法醫(yī)病理學(xué)；青壯年猝死綜合征；5-羥色胺；5-羥色胺轉(zhuǎn)運體；免疫組化

[中圖分類號] RF795.1[文獻標識碼] B[文章編號] 1673-9701（2014）15-0061-02

Immunohistochemical study on SMDS dorsal nucleus raphe 5-serotonin and 5-serotonin transporter

WU Hua1 TANG Qun2 QU Zhixiong1WANG Jian1 WANG Xinghua1

1.Furong Judicial Identification Center of the Second People's Hospital of Hunan Province, Changsha 410007,China；2. Department of Pathology of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China

[Abstract] Objective To investigate the 5- serotonin and 5-serotonin transporter expression and significance in brain tissue of sudden manhood death syndrome. Methods Used immunohistochemical S-P staining method in 10 cases of normal brain tissues and 8 cases of sudden manhood death syndrome in expression of 5-HT and 5-serotonin transporter in the brain tissue, using image analysis technique to measure the mean optical density of positive cells of value. Results The average optical density of the 5- serotonin in the dorsal nucleus raphe of sudden manhood death syndrome was lower than that in normal brain tissue, and the average optical density of 5-serotonin transporter was higher than that in normal brain tissue, the differences were statistically significant(P < 0.05). Conclusion The changes of 5- HT and 5- serotonin transporter were involved in the pathogenesis of sudden manhood death syndrome, which can be used as a reference marker for diagnosis of sudden manhood death syndrome.

[Key words] Forensic pathology; Sudden manhood death syndrome; 5-serotonin; 5-serotonin transporter; Immunohistochemistry本實驗通過觀察青壯年猝死征（sudden manhood death syndrome ，SMDS）死者腦干中縫背核中5-羥色胺（5-ydroxytryptamine，5-HT）及5-羥色胺轉(zhuǎn)運體（5-HT transporter，5-HTT/ serotonin transporter，SERT）的表達變化，探討5-HT、SERT與SMDS之間的關(guān)系，以期為SMDS的死因分析研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本與主要試劑、儀器

18例腦組織標本來源于湖南省第二人民醫(yī)院芙蓉司法鑒定中心和湖南中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室。其中青壯年猝死綜合征8例（SMDS組），尸體檢驗及組織學(xué)檢查未見明顯異常，毒物分析陰性；正常腦組織10例（正常對照組），均死于交通事故顱腦損傷，生前無腦部疾患。主要試劑與儀器：兔抗人5-HT、5-HTT多克隆抗體、通用型S-P免疫組織化學(xué)試劑盒和DAB顯色試劑盒（福建邁新生物科技開發(fā)公司），顯微圖像分析系統(tǒng)（北京麥克奧迪公司）。

1.2 取材

18例腦組織標本每例取腦干中縫背核，10%福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，進行5-HT及5-HTT免疫組化染色。

1.3 免疫組化染色

按S-P免疫組織化學(xué)試劑盒說明書進行操作。5-HT、5-HTT一抗工作濃度分別為1∶200和1∶100，用PBS代替一抗作陰性對照。顯微鏡下觀察細胞染色情況，胞漿和胞膜染成黃色，含有粗細不一的棕黃色顆粒即為陽性細胞，蘇木素輕度復(fù)染細胞核。

1.4 圖像分析

Olympus顯微鏡觀察每張切片，并隨機選取5個視野，用麥克奧迪顯微圖像分析系統(tǒng)對5-HT、SERT的表達進行定量測量，測量免疫組化陽性細胞的平均光密度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間差異比較采用t檢驗， P < 0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5-HT免疫組化染色結(jié)果

鏡下觀察5-HT的表達情況，正常對照組腦干中縫背核5-HT呈高度表達，被染成棕褐色，而SMDS組5-HT呈低度表達，被染成淡黃色。SMDS組5-HT的平均光密度值（0.185±0.055），低于正常對照組（0.394±0.098），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），說明青壯年猝死綜合征腦內(nèi)5-HT在腦內(nèi)中縫背核的表達明顯低于正常組。見表1。

2.2 5-HTT免疫組化染色結(jié)果

鏡下觀察5-HTT的表達情況，正常對照組腦干中縫背核5-HTT呈中度表達，被染成棕黃色，而SMDS組5-HTT呈高度表達，被染成棕褐色。SMDS組5-HTT的平均光密度值（0.368±0.086）高于正常對照組（0.225±0.089），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），說明青壯年猝死綜合征腦內(nèi)5-HTT在腦內(nèi)中縫背核的表達明顯高于正常組。見表1。

表1 5-HT、5-HTT在兩組腦干中縫背核平均光密度值的變化

注：與正常對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）

3 討論

SMDS是一種原因未明的猝死，具有死于睡眠中、多為青壯年、絕大多數(shù)為男性、生前多身體健康、死亡迅速、尸體剖驗不能發(fā)現(xiàn)足以說明其死因的病理變化等特點[1]。目前，對于此類鑒定通常是在排除暴力、中毒和器質(zhì)性疾病等死因后做出推測性結(jié)論[2]。由于死因不明，缺乏確切的診斷依據(jù)，易引起糾紛訴訟，而從分子生物學(xué)方面進行研究，可望有所突破。

5-HT最早是從血清中發(fā)現(xiàn)的，又名血清素（serotonin），是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)[3]，其與呼吸、心血管系統(tǒng)、情緒、睡眠、感覺、體溫調(diào)節(jié)、內(nèi)分泌功能及神經(jīng)的發(fā)育調(diào)節(jié)都有密切關(guān)系[4]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT能神經(jīng)元主要分布于腦干中縫核區(qū)和旁正中區(qū)，這些神經(jīng)元共同組成了腦干血清素系統(tǒng)[5]，其神經(jīng)纖維廣泛地延伸到腦干的自主神經(jīng)核、呼吸神經(jīng)核及脊髓中，協(xié)助調(diào)節(jié)機體功能。SMDS多發(fā)生在睡眠過程中，因此推測其發(fā)病過程可能與中樞神經(jīng)遞質(zhì)5-HT的含量及功能異常有關(guān)。Portas等[6]研究發(fā)現(xiàn)，中縫背核的5-HT能神經(jīng)元電活動和5-HT能神經(jīng)纖維的投射區(qū)域5-HT的釋放量在睡眠期減少，在覺醒期增加，中縫背核的5-HT神經(jīng)元參與睡眠調(diào)節(jié)，興奮5-HT神經(jīng)元使睡眠減少，抑制則促進睡眠，顯示5-HT有促覺醒作用。香松林等[7]提高腦脊液5-羥色胺濃度可改善大鼠中樞性睡眠呼吸暫停。Klintschar認為，5-HT相關(guān)基因異?？赡苁菋雰衡谰C合征的發(fā)病機制[8]。本實驗結(jié)果顯示，SMDS組5-HT在腦干中縫背核的表達較正常對照組減弱，提示中樞神經(jīng)遞質(zhì)，5-HT的含量降低可能導(dǎo)致，SMDS患者睡眠異常，促發(fā)睡眠呼吸暫停導(dǎo)致青壯年猝死的發(fā)生。5-HTT是一種對5-HT有高度親和力的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，廣泛存在于大腦邊緣系統(tǒng)和5-羥色胺能神經(jīng)突觸前膜上。5-HTT從神經(jīng)突觸間隙中再攝取5-HT進入突觸前神經(jīng)元，使其滅活，從而使突觸間隙的5-HT水平降低[9]。因此，5-HTT從突觸間隙中再攝取5-HT而對突觸后受體介導(dǎo)信號的量和作用持續(xù)時間產(chǎn)生影響，從而在5-羥色胺神經(jīng)傳遞的微調(diào)中起關(guān)鍵作用。本實驗結(jié)果顯示，SMDS組5-HTT在腦干中縫背核的表達較正常對照組增強，提示5-HTT從突觸間隙中再攝取5-HT增加，進一步導(dǎo)致突觸間隙的5-HT水平降低，后者可影響上氣道擴張肌的張力，引起患者上氣道塌陷，從而引起患者窒息，促進SMDS的發(fā)生。

SMDS的死因與機制尚不十分清楚，至今有心臟性猝死、呼吸性猝死、機械刺激、噩夢、內(nèi)分泌等多種學(xué)說。本研究結(jié)果提示，5-HT、5-HTT可作為診斷SMDS的參考指標。同時，推測SMDS死者中縫背核5-HT表達降低、5-HTT表達增強是其死前伴呻吟、呼吸困難、呼之不應(yīng)的組織學(xué)基礎(chǔ)。

[參考文獻]

[1]王寶捷. 法醫(yī)學(xué)[M]. 第5版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2008: 109-110.

[2]趙乾皓，劉 超，盧龍武，等. 青壯年猝死綜合征鉀離子通道KCNQ1、KCNH2、KCNE1和KCNE2基因的變異[J]. 法醫(yī)學(xué)雜志，2012，28（5）:337-341，346.

[3]蔡書景，郭秀英. 肝性腦病大鼠中縫核群內(nèi)5-羥色胺表達的研究[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，22（22）:2421-2423.

[4]Sahni R， Fifer WP， Myers MM. Identifying infants at risk for sudden infant death syndrome[J]. Curr Opin Pediatr， 2007，19（2）:145-149.

[5]RichersonGB. Serotonin:The anti-sudden death amine[J].Epilepsy Curr，2013，13（5）:241-244.

[6]Van Oekelen D，Luyten WH，Leysen JE. 5-HT2A and 5-HT2C receptors and their atypical regulation properties[J]. Life Sci，2003，72:2429-2449.

[7]香松林，張成，楊國輝，等 腦脊液5-羥色胺濃度對大鼠中樞性睡眠呼吸暫停的影響[J]. 貴州醫(yī)藥，2013，37（4）:291-295.

[8]Klintschar M. The association between polymorphisms in serotonin-related genes and pain modulation might be of importance for the pathogenesis of sudden infant death syndrome[J]. J Pain，2012 ，13（5）:516.

[9]藍孝斐，李慶云，周麗娜. 5-羥色胺與阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征關(guān)系的研究進展[J]. 中國呼吸與危重監(jiān)護雜志，2012，11（6）:610-613.

（收稿日期：2014-01-17）