羅亦靈，石 磊，王穎鈺，沈明勤*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，南京 210023；2.江蘇省中醫(yī)藥研究院，南京 210028)

肝臟損傷是由各種有害因子和物質(zhì)引起肝臟生理和病理異常的病變過程，其發(fā)生機(jī)制頗為復(fù)雜，涉及炎癥反應(yīng)、免疫功能紊亂、自由基損害等多個病理生理過程。復(fù)方龍葵顆粒的處方源自南京中醫(yī)藥大學(xué)博士生導(dǎo)師、省級名老中醫(yī)金實教授的經(jīng)驗效方“龍柴湯”，臨床上用于治療慢性乙型肝炎[1]，本文擬從復(fù)方龍葵顆粒對CCl4誘發(fā)的大鼠肝損傷模型血清TNF-α、IL-6、IL-10的影響探討其主要的作用機(jī)制。

1 實驗材料

清潔級SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量170～240 g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2012-0002。龍葵顆粒(浸膏):2.95 g生藥/g，由江蘇省中醫(yī)藥研究院制劑室提供，批號：20120510。聯(lián)苯雙酯片：25 mg/片，江蘇鵬鷂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：1111142。腫瘤壞死因子(TNF-α)和白細(xì)胞介素(IL-6、IL-10)試劑盒：R&D Systems，批號：302054，300358，300244。其他試劑：均為市售分析純產(chǎn)品。7060型自動生化分析儀：日本日立(HITACHI)生產(chǎn)；METTLER PB303-N電子天平:上海產(chǎn)；TDL-S-A臺式高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

2 實驗方法[2-4]

2.1 建立CCl4大鼠慢性肝損傷動物模型 清潔級SD大鼠60只,雌雄各半。隨機(jī)取10只(雌雄各半)作為正常對照組。其余50只于第1周開始給予25%的CCl4花生油溶液3 mL/kg，2次/周，1次皮下注射和1次灌胃交替造模，連續(xù)10周。

2.2 分組及給藥 實驗大鼠共分6組。除正常對照組外，所有造模大鼠按照體質(zhì)量隨機(jī)分為5組，每組10只(模型對照組，陽性藥對照組，龍葵顆粒大、中、小劑量組)。于造模第3周起,龍葵顆粒大、中、小劑量組大鼠予以龍葵顆粒浸膏灌胃，劑量分別為10、5、2.5 g生藥/kg。陽性藥對照組大鼠以聯(lián)苯雙酯50 mg/kg灌胃。模型對照組和正常對照組大鼠灌胃給予等量生理鹽水，各鼠按10 mL/kg每日灌胃1次，連續(xù)10周，所有造模大鼠同時繼續(xù)造模。

2.3 取材 末次給藥后，大鼠禁食不禁水16 h后用10%水合氯醛按0.3 mL/kg體質(zhì)量腹腔注射麻醉，采血分離血清，-80 ℃保存。

2.4 血清生化指標(biāo)的檢測 ALT，AST用全自動生化分析儀檢測；血清中TNF-α、IL-6、IL-10的變化：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA法)。

3 實驗結(jié)果

3.1 對慢性肝損傷大鼠生化指標(biāo)的影響 各給藥組的ALT明顯低于模型對照組(P<0.05～0.01)，龍葵顆粒大、中劑量組大鼠的ALT、AST基本接近正常空白對照組的水平。見表1。

組 別ALT/(U/L)AST/(U/L)空白對照組 33±18##103±30##模型對照組 86±41 216±90 陽性對照組(0.05 g/kg)53±17# 127±28# 龍葵大劑量組(10 g/kg)39±17## 99±16##龍葵中劑量組(5 g/kg)41±18##115±44##龍葵小劑量組(2.5 g/kg)49±29# 141±77

注：與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3.2 對慢性肝損傷大鼠TNF-α、IL-6、IL-10的影響 服用一定劑量的龍葵顆?？梢燥@著抑制慢性肝損傷大鼠TNF-α、IL-6的異常降低，使它們基本接近正常水平，這些可能是龍葵顆粒治療慢性肝損傷的重要作用機(jī)制。見表2。

表2 龍葵顆粒對TNF-α、IL-6、IL-10的影響 pg/mL

注：與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

4 討論

TNF-α作為一種多功能的細(xì)胞因子,其作用具有雙重性,在正常情況下,局部適量濃度具有抗腫瘤、抗感染增強(qiáng)免疫力等作用，但大量TNF-α持續(xù)釋放會導(dǎo)致惡化病變,使其在疾病的發(fā)展過程中處于特殊地位[5]。IL-6具有肝臟保護(hù)作用,可能與其抗炎性質(zhì)、對TNF-α的調(diào)節(jié)作用和增強(qiáng)肝細(xì)胞再生有關(guān)，TNF-α可誘導(dǎo)IL-6的合成，而IL-6抑制TNF-α的產(chǎn)生[6]。

本次試驗中，模型組血清ALT、AST水平與正常組比較明顯升高(P<0.01)，模型復(fù)制成功[7]，但是血清TNF-α、IL-6水平降低(P<0.01),與相關(guān)文獻(xiàn)報道存在差異[8-9]，可能是因為TNF-α水平與肝細(xì)胞損傷的程度關(guān)聯(lián)度不強(qiáng)，而與肝細(xì)胞的修復(fù)及機(jī)體免疫系統(tǒng)的功能恢復(fù)密切相關(guān),機(jī)體在不同的疾病階段(免疫耐受期、病毒消除期、病毒靜止期), TNF-α水平也不同; 也可能與TNF-α的雙重性有關(guān), TNF-α可以由多種細(xì)胞分泌產(chǎn)生，且多種細(xì)胞因子、多種因素途徑可以刺激TNF-α的分泌。這些實驗結(jié)果有待進(jìn)一步的研究和探討。

本次試驗提示，復(fù)方龍葵顆粒治療慢性肝損傷的重要機(jī)制可能與其能夠抑制大鼠血清中TNF-α、IL-6水平的異常降低，增強(qiáng)機(jī)體免疫能力有關(guān)[10]。

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