王亞男，黃鶴平，鄒志艷，馬丹煒，羅 通，楊 歡，何 兵，張 紅，李 群

(1.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川成都610101； 2.昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)院，云南昆明650214；3.宜賓學(xué)院生物研究所，四川宜賓644007)

麻風(fēng)樹(Jatropha curcasLinn.)屬于大戟科大戟屬，原產(chǎn)于中美洲和南美洲，現(xiàn)廣泛分布于中美洲、非洲和亞洲［1］.麻風(fēng)樹種仁的含油量最高可達(dá)61.5%，是一種熱帶地區(qū)極為適宜的生物柴油原料植物［2］，已在薩赫勒地區(qū)和撒哈拉以南的非洲國(guó)家以及亞洲國(guó)家(中國(guó)、泰國(guó)、印度尼西亞和印度大部分地區(qū)等)大力推廣種植［3］.2009年6月，中國(guó)國(guó)家發(fā)展和改革委員會(huì)批準(zhǔn)了3個(gè)以麻風(fēng)樹籽油為原料的“油林”一體化生物柴油國(guó)家示范項(xiàng)目，標(biāo)志著中國(guó)麻風(fēng)樹生物柴油正式走向了產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用［4］.然而，C.E.Buddenhagen等［5］應(yīng)用雜草評(píng)估系統(tǒng)評(píng)估了夏威夷島的40種生物燃料作物的入侵特征，發(fā)現(xiàn)麻風(fēng)樹具有較高的歸化性和入侵性特征.全球入侵物種編目已經(jīng)把麻風(fēng)樹歸為高入侵風(fēng)險(xiǎn)植物，雖然尚未對(duì)此進(jìn)行科學(xué)論證，但是包括澳大利亞、南非、厄瓜多爾、關(guān)島、新喀里多尼亞、印度的部分城市等國(guó)家和地區(qū)因此已將麻風(fēng)樹歸為入侵植物而禁止種植［3］.目前，麻風(fēng)樹已在中國(guó)云南、貴州、四川等地大面積種植，若上述假設(shè)成立，麻風(fēng)樹將對(duì)這些地區(qū)的生態(tài)系統(tǒng)形成威脅，因此，正確評(píng)價(jià)麻風(fēng)樹的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)迫在眉睫.

化感作用是外來植物主要的入侵機(jī)理之一［6-7］.外來植物向周圍釋放化感物質(zhì)，這些化感物質(zhì)通過受體植物細(xì)胞膜上的受體將化感脅迫信號(hào)傳入細(xì)胞內(nèi)部，影響新陳代謝過程［8］，抑制周圍植物的生長(zhǎng)發(fā)育.根尖細(xì)胞對(duì)外界環(huán)境脅迫十分敏感，根邊緣細(xì)胞在根表面和土壤界面構(gòu)建一個(gè)生物活性界面，是保護(hù)植物根尖免受生物和非生物脅迫的第一道防線［9］.外來入侵植物通過雨霧淋溶、自然揮發(fā)、根系分泌和殘株腐解等途徑向周圍環(huán)境釋放的化感物質(zhì)最終都將進(jìn)入土壤［10］，作用于受體植物的根邊緣細(xì)胞和根尖細(xì)胞.近些年，麻風(fēng)樹的化感作用引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注［11-12］，但麻風(fēng)樹對(duì)植物根尖細(xì)胞化感作用的研究較少.鄧騖遠(yuǎn)等［13］研究表明麻風(fēng)樹水浸提液導(dǎo)致蠶豆根尖細(xì)胞的畸變率和微核率升高，具有一定的遺傳毒性.本研究在此基礎(chǔ)上，以中國(guó)旱地廣泛種植的大豆為受體植物，進(jìn)一步考察了麻風(fēng)樹葉水浸提液對(duì)其根邊緣細(xì)胞、根尖細(xì)胞丙二醛(MDA)含量、抗氧化酶活性的影響以及由其誘導(dǎo)的遺傳毒性，以期了解麻風(fēng)樹釋放的化感物質(zhì)對(duì)根尖及其保護(hù)屏障的影響，揭示麻風(fēng)樹的化感作用機(jī)制，為驗(yàn)證麻風(fēng)樹是否屬于高入侵風(fēng)險(xiǎn)植物提供相關(guān)證據(jù)，并為生物柴油原料植物的可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料供體植物麻風(fēng)樹葉片采自四川省攀枝花市仁和區(qū)沙溝，采后置于陰涼處陰干；受體植物大豆種子(“鐵豐29號(hào)”)購(gòu)自成都市種子市場(chǎng).

1.2 水浸提液的制備將陰干后的麻風(fēng)樹葉片剪成2 cm2左右碎片，裝入錐形瓶中，按照1∶20的比例加入蒸餾水，混勻后在25℃下?lián)u床振蕩48 h，2層紗布過濾2次后，得0.05 g/mL的母液(其他處理質(zhì)量濃度以此為基礎(chǔ)配制)，放入4℃冰箱備用.實(shí)驗(yàn)設(shè)置0.01、0.02、0.03、0.04 和0.05 g/mL 等 5個(gè)質(zhì)量濃度處理水平，以蒸餾水作對(duì)照.

1.3 材料培養(yǎng)及處理選擇飽滿、健康無損傷的大豆種子，用蒸餾水漂洗2次，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%KMnO4浸泡消毒10 min，洗凈后用蒸餾水浸種12 h.將充分吸脹的大豆均勻置于鋪有濕潤(rùn)紗布的潔凈瓷盤中，其上覆蓋一層濕潤(rùn)紗布，然后放入(25±1)℃的培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)至種子露白.待根長(zhǎng)約30 mm時(shí)，移至底部墊有濾紙的直徑為12 cm的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿放置15粒種子，其上覆蓋一層濾紙.分別噴入10 mL 0.01～0.05 g/mL麻風(fēng)樹葉片水浸提液，以蒸餾水作對(duì)照，然后蓋上培養(yǎng)皿蓋，置于(25±1)℃培養(yǎng)箱中分別暗培養(yǎng)6、12和24 h，每處理重復(fù)3次.培養(yǎng)結(jié)束后取樣進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定.

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 大豆根尖果膠甲基酯酶(PME)活性以及根邊緣細(xì)胞數(shù)目 1)PME活性:隨機(jī)挑選各處理組10個(gè)根，剪取2～3 mm的根尖，置于含200 μL的PME提取液(檸檬酸0.1 mol/L、Na3PO40.2 mol/L、NaCl 1 mol/L)的研缽中，冰浴下充分研磨后倒入1.5 mL離心管中，充分振蕩，冰浴2 h，每隔30 min振蕩1次，后置于4℃、15 000 r/min下離心10 min，收集上清液，-20℃保存.PME活性檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)［14］的方法，PME活性用1 h每個(gè)根尖催化果膠釋放1 μmol的H+為一個(gè)酶活力單位(用U表示)，重復(fù)3次.2)邊緣細(xì)胞數(shù)目:隨機(jī)挑選各處理組5個(gè)根，分別切取5 mm左右的根尖，移至預(yù)先裝有100 μL H2O的1.5 mL離心管中，振蕩儀振蕩數(shù)秒，使邊緣細(xì)胞在水中充分展開，制成根邊緣細(xì)胞懸液.取細(xì)胞懸浮液10 μL置于另一0.5 mL的離心管中，依次加入100 μg/mL的溴化乙錠和吖啶橙各2 μL，避光染色2 min，熒光顯微鏡下鏡檢(活細(xì)胞為綠色，死細(xì)胞為橘紅色)，記錄觀察根邊緣細(xì)胞數(shù)目，參考文獻(xiàn)［15］的方法計(jì)算細(xì)胞數(shù)，重復(fù)3次.

1.4.2 大豆根尖細(xì)胞抗氧化酶活性 1)粗酶液的提取:分別切取1.3中處理后的根尖0.5 g，加入5 mL pH 7.0的磷酸緩沖液(PBS)冰浴研磨，4℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液即為粗酶液，低溫貯藏備用.2)抗氧化酶活性的測(cè)定:超氧化酶歧化酶(SOD)活性采用氯化硝基四氮唑藍(lán)法測(cè)定［16］；過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定［16］；過氧化氫酶(CAT)活性采用H2O2分解法測(cè)定［17］.

1.4.3 大豆根尖細(xì)胞MDA含量和微核率1)MDA含量:MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法［18］.稱取一定量的大豆根尖，置于研缽中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%三氯乙酸冰浴研磨，10 min后4 000 r/min離心10 min，取上清液備用.取上清液1 mL，加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%硫代巴比妥酸溶液，100℃水浴20 min，迅速冷卻后離心，分別測(cè)定上清液在532、600和450 nm處的吸光值.計(jì)算MDA的含量.2)微核率:選取根長(zhǎng)萌發(fā)至0.5 cm左右的種子，置于底部墊有濾紙的直徑為12 cm的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿放置15粒種子，其上覆蓋一層濾紙.分別噴入10 mL 0.01～0.05 g/mL各設(shè)置質(zhì)量濃度麻風(fēng)樹葉片水浸提液，蓋上培養(yǎng)皿蓋，于(25±1)℃培養(yǎng)箱中，暗培養(yǎng)6、12和24 h，然后用蒸餾水浸洗3次，每次3 min，移至(25±1)℃恒溫箱中恢復(fù)培養(yǎng)24 h，然后切取長(zhǎng)度為1 cm左右的根尖用Carnoy固定液固定24 h，質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%乙醇于4℃保存?zhèn)溆?取固定根尖用1 mol/L HCl 60℃解離，Schiff試劑染色，壓片后鏡檢，每個(gè)根尖計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞，每個(gè)處理組統(tǒng)計(jì)5個(gè)根尖.微核率用根尖分生區(qū)間期細(xì)胞出現(xiàn)微核的百分率表示.

1.5 數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)和多重比較(LSD法).

2 結(jié)果與分析

2.1 麻風(fēng)樹葉水浸提液對(duì)大豆根尖邊緣細(xì)胞的影響

2.1.1 邊緣細(xì)胞數(shù)目 邊緣細(xì)胞是從根冠表皮游離出來并聚集在根尖周圍的一群特殊細(xì)胞，是保護(hù)植物根尖的第一道防線［19］.麻風(fēng)樹葉水浸提液對(duì)大豆根邊緣細(xì)胞數(shù)目的影響見表1.與對(duì)照相比，各處理時(shí)間段大豆根邊緣細(xì)胞的數(shù)量均表現(xiàn)出隨著葉水浸提液質(zhì)量濃度的升高而先增高后降低的趨勢(shì)，且處理間存在顯著性差異(P＜0.05).其中，水浸提液處理6 h后，各劑量組根邊緣細(xì)胞的數(shù)量均顯著高于對(duì)照，并在0.01 g/mL處理組達(dá)到最高值，比對(duì)照顯著提高107%；處理12和24 h時(shí)，細(xì)胞數(shù)目分別在0.01和0.02 g/mL質(zhì)量濃度處理時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)分別比對(duì)照顯著提高35%和27%.這表明大豆根尖在受到麻風(fēng)樹葉水浸提液脅迫時(shí)，可產(chǎn)生大量根邊緣細(xì)胞；隨著麻風(fēng)樹葉水浸提液質(zhì)量濃度的增加，根邊緣細(xì)胞總數(shù)降低；水提液質(zhì)量濃度超過0.04 g/mL，12和24 h處理組細(xì)胞總數(shù)顯著低于對(duì)照，同時(shí)通過溴化乙錠和吖啶橙染色觀察到各處理組有大量邊緣細(xì)胞死亡(數(shù)據(jù)未列).

表1 麻風(fēng)樹葉水浸提液對(duì)大豆根尖邊緣細(xì)胞數(shù)目和PME活性的影響Table 1 Effects of aqueous leaf extracts of Jatropha curcas on the number of root border cells and PME activity of soybean

2.1.2 根冠PME活性 根冠PME在根緣細(xì)胞的發(fā)育中有重要作用，其活性與根緣細(xì)胞的產(chǎn)生和誘導(dǎo)呈正相關(guān)［20］.大豆根尖PME活性隨麻風(fēng)樹葉水浸提液質(zhì)量濃度的增加均表現(xiàn)為逐漸升高的趨勢(shì)(表1)，除處理24 h的0.01、0.02和0.03 g/mL處理組水浸提液對(duì)大豆根冠PME活性影響不顯著外，其余處理質(zhì)量濃度和處理時(shí)間下的大豆根冠PME活性均顯著高于對(duì)照(P＜0.05).通過比較發(fā)現(xiàn)，6 h處理組PME活性的上升幅度較大.

2.2 麻風(fēng)樹葉水浸提液對(duì)大豆根細(xì)胞抗氧化酶活性的影響細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)主要包括SOD、CAT和POD等，能夠?qū)⒓?xì)胞內(nèi)的氧自由基控制在0.2%左右，使機(jī)體免遭氧自由基的損傷［21］.麻風(fēng)樹葉水浸提液對(duì)大豆根細(xì)胞抗氧化酶活性具有一定的影響(圖1)，其中，SOD和POD活性隨質(zhì)量濃度變化的趨勢(shì)基本一致，均表現(xiàn)為隨著麻風(fēng)樹葉水浸提液質(zhì)量濃度的升高先降低后升高，而CAT活性的變化趨勢(shì)較為復(fù)雜.在處理時(shí)間較短時(shí)(6 h)，CAT活性隨著葉水浸提液質(zhì)量濃度的升高而表現(xiàn)出降低—升高—降低的趨勢(shì)；隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)(12和24 h)，CAT活性則整體表現(xiàn)為下降的趨勢(shì).各處理時(shí)間下各處理質(zhì)量濃度組的SOD活性均與對(duì)照無顯著差異(P＞0.05)；除了6 h處理組的0.03和0.04 g/mL、12 h處理組的0.01和0.02 g/mL外，6 h處理組和12 h處理組各處理質(zhì)量濃度，大豆根尖POD活性均與對(duì)照存在顯著差異(P＜0.05)，而24 h處理組則無顯著變化(P＞0.05)；除0.05 g/mL水浸提液處理24 h的大豆根尖CAT活性與對(duì)照差異顯著(P＜0.05)外，其余處理和時(shí)間均未達(dá)到顯著性差異.

2.3 麻風(fēng)樹葉水浸提液誘導(dǎo)的膜脂過氧化和遺傳損傷

2.3.1 MDA含量 MDA是機(jī)體受到氧化脅迫時(shí)，脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物［22］.在麻風(fēng)樹葉水浸提液作用下，大豆根尖細(xì)胞MDA含量的變化如圖2所示.整體來看，在24 h處理組中，隨著麻風(fēng)樹葉水浸提液質(zhì)量濃度的升高，大豆根尖細(xì)胞中MDA含量先增加后減少；而6和12 h處理組變化趨勢(shì)不明顯，各處理組大豆根尖MDA含量的差異均未達(dá)到顯著性差異(P＞0.05).這些結(jié)果說明，麻風(fēng)樹水浸提液未引起大豆根尖細(xì)胞膜質(zhì)過氧化.

圖1 麻風(fēng)樹水浸提液對(duì)大豆根細(xì)胞抗氧化酶活性的影響Fig.1 Effects of leaf aquatic extracts from Jatropha curcas on the activities of antioxidant enzymes of soybean

圖2 麻風(fēng)樹水浸提液對(duì)大豆根細(xì)胞MDA含量的影響Fig.2 Effects of leaf aquatic extracts from Jatropha curcas on MDA contents of soybean

2.3.2 微核率 微核是染色體畸變?cè)陂g期細(xì)胞中的一種表現(xiàn)形式，通過觀察微核的形成來檢測(cè)遺傳毒性［23］.麻風(fēng)樹葉片水浸提液可誘導(dǎo)大豆根尖細(xì)胞出現(xiàn)微核(表2).3個(gè)處理時(shí)間中，不同處理質(zhì)量濃度的大豆根細(xì)胞微核率均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05).當(dāng)水浸提液質(zhì)量濃度為0.03 g/mL時(shí)，微核率達(dá)到最大，隨著處理液質(zhì)量濃度進(jìn)一步升高，微核率有所下降，可能是由于水浸提液細(xì)胞毒性強(qiáng)，阻止根尖細(xì)胞有絲分裂的進(jìn)行.

3 討論

3.1 麻風(fēng)樹對(duì)根邊緣細(xì)胞的化感效應(yīng)根邊緣細(xì)胞是當(dāng)根尖浸入水中時(shí)能擴(kuò)散到懸浮液中的那些細(xì)胞，由根冠細(xì)胞發(fā)育而來.根冠PME與根邊緣細(xì)胞的釋放具有密切的關(guān)系.根邊緣細(xì)胞及其相關(guān)的黏液層在植物生長(zhǎng)過程中起到多重功能，并在抵抗生物與非生物脅迫中起作用［9，24］.進(jìn)入土壤的化感物質(zhì)需要先突破根邊緣細(xì)胞這層保護(hù)屏障后，才能作用于根尖細(xì)胞并干擾其生命活動(dòng)過程.在入侵植物反枝莧(Amaranthus retroflexusL.)［25］、加拿大蓬(Erigeron canadensisL.)［26］和土荊芥(Chenopodium AmbrosioidesL.)［27］化感脅迫下，隨著處理質(zhì)量濃度(劑量)升高，受體植物根邊緣細(xì)胞存活率下降，根冠PME活性升高.本研究結(jié)果與此一致，在短時(shí)間(6 h)受到麻風(fēng)樹水浸提液作用時(shí)，大豆幼根通過提高PME活性加快釋放根邊緣細(xì)胞，由根邊緣細(xì)胞及其黏液層中和化感物質(zhì)，來緩解麻風(fēng)樹的化感脅迫.但是隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)(12和24 h)和水浸提液質(zhì)量濃度的增加，雖然根尖PME活性仍很高，但根邊緣細(xì)胞數(shù)目有所降低，表明面對(duì)脅迫植物所接受的信號(hào)可能是對(duì)根邊緣細(xì)胞的大量需求，因此通過反饋繼續(xù)提高PME的表達(dá)，但由于其已大大超過根尖產(chǎn)生新根邊緣細(xì)胞的能力，所以根邊緣細(xì)胞數(shù)目降低，同時(shí)試驗(yàn)中觀察到根邊緣細(xì)胞大量死亡，表明麻風(fēng)樹水浸提液對(duì)根邊緣細(xì)胞具有細(xì)胞毒性.

3.2 麻風(fēng)樹對(duì)根尖細(xì)胞的化感效應(yīng)許多植物的化感物質(zhì)具有遺傳毒性和細(xì)胞毒性，影響細(xì)胞的有絲分裂過程［28-30］.微核試驗(yàn)是檢測(cè)染色體或有絲分裂器損傷的一種遺傳毒性試驗(yàn)方法［23］.無著絲粒的染色體片段或因紡錘體受損而丟失的整個(gè)染色體，在細(xì)胞分裂后期仍留在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)成為微核.微核為游離于主核之外且和主核著色一致圓形或橢圓形的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu).胡琬君等［31］發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同劑量土荊芥揮發(fā)油處理后，蠶豆根尖細(xì)胞出現(xiàn)多種類型的染色體畸變，微核率顯著高于對(duì)照，在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng).本課題組前期研究表明［13］，麻風(fēng)樹水溶性化感物質(zhì)具有較強(qiáng)的遺傳毒性.在麻風(fēng)樹葉水浸提液作用下，蠶豆根尖細(xì)胞出現(xiàn)染色體畸變現(xiàn)象，微核率和畸變率均明顯高于對(duì)照.本研究進(jìn)一步印證了這一結(jié)論，大豆根尖細(xì)胞的微核率隨著麻風(fēng)樹水浸提液處理時(shí)間和處理質(zhì)量濃度增加而升高.當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.03 g/mL后，微核率雖然有所下降，由于水提液對(duì)大豆根尖細(xì)胞毒性較強(qiáng)，阻止其有絲分裂的進(jìn)行，導(dǎo)致微核率有所下降，但仍然高于對(duì)照，表明麻風(fēng)樹水浸提液對(duì)大豆根尖細(xì)胞具有遺傳毒性.同時(shí)本研究結(jié)果表明，麻風(fēng)樹水浸提液未誘導(dǎo)大豆根尖細(xì)胞的氧化損傷，提示其可能表現(xiàn)為直接的遺傳毒性，引起DNA損傷或破壞了紡錘絲的結(jié)構(gòu)與功能，由此形成的染色體斷片或滯后染色體，在子核重建時(shí)形成了游離于主核的微核.

表2 麻風(fēng)樹葉水浸提液對(duì)大豆根尖細(xì)胞微核率的影響Table 2 Effect of the leaf aqueous extracts from Jatropha curcas on micronucleus rate of soybean root tip cells

綜上所述，麻風(fēng)樹水浸提液對(duì)大豆根尖抗氧化系統(tǒng)的影響不大，但表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒性和遺傳毒性.當(dāng)麻風(fēng)樹的化感物質(zhì)釋放到環(huán)境以后，通過降低受體植物根邊緣細(xì)胞的存活率，干擾根邊緣細(xì)胞的保護(hù)功能，進(jìn)而影響受體植物根尖細(xì)胞有絲分裂過程，最終導(dǎo)致受體植物生長(zhǎng)發(fā)育受阻.因此，在大規(guī)模引種麻風(fēng)樹前，應(yīng)對(duì)其潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)做預(yù)警分析.

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