張 伶， 陳 柳， 胡德鳳， 邢菲菲， 張 宏， 陳 放

(1.中國人民解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院腫瘤診治中心放療科，四川成都610083;2.四川師范大學生命科學學院，四川成都610101;3.四川大學生命科學學院，四川成都610041)

惡性腫瘤居全球死亡原因的第二位，至今仍缺乏有效的治療方法.西紅花屬鳶尾科植物.西紅花提取物(SE)具有降血壓、抗血栓、免疫調節(jié)等藥理作用.另外，近年研究還發(fā)現(xiàn)西紅花具有抑制多種惡性腫瘤增殖、誘導細胞凋亡、阻滯細胞周期進程(肝癌、腸癌、前列腺癌、胃癌及宮頸癌等)［1-5］等抗腫瘤活性.其中抗腫瘤活性的主要成分是西紅花酸及西紅花糖苷［6］.然而由于原材料昂貴、理化性質不明確、藥物性能穩(wěn)定性差等原因限制了西紅花抗腫瘤應用的發(fā)展.然而化學合成的西紅花酸和西紅花糖苷彌補了以上不足，但其抗腫瘤作用有待證實.本實驗首次檢測了合成的西紅花酸及8種西紅花糖苷對多種腫瘤細胞的體外抗腫瘤活性，并初步探討了其抗瘤機制.

1 材料、試劑與儀器

材料:人結腸癌細胞系 HCT116、HT-29、LOVO、SW480、SW620、人胸腺癌細胞系 MCF-7、人肺癌細胞系A549、人肝癌細胞系BELE-7402由四川師范大學生命科學學院實驗室提供.提取SE的西紅花原料購于四川中藥材有限公司，經(jīng)四川大學生命科學學院陳放教授鑒定為鳶尾科植物西紅花(Saffron)干燥的花莖;合成的西紅花糖苷由四川師范大學張宏教授實驗室合成并提供，經(jīng)核磁共振(NMR)及質譜(MS)確定其結構，由HPLC測定其純度均≥98%(見圖1).

試劑:抗人p53單克隆抗體(中國中杉金橋公司);MTT試劑盒(美國Sigma公司).

儀器:酶標儀、Western blot轉膜儀(美國Bio-RAD公司);流式細胞儀(美國COULTER公司).

2 實驗方法

2.1 西紅花有效成分的提取 取西紅花干燥柱頭30 g，加入300 mL體積分數(shù)50%的乙醇，超聲提取30 min，過濾，旋轉蒸發(fā)至無乙醇，冷凍干燥，得西紅花提取物(saffron extraction，SE)，備用.

2.2 MTT法檢測細胞增殖 待測細胞以每孔2.5×103個接種于96孔板.加實驗樣品(處理藥物)100 μL，濃度為 0、0.937 5、1.875、3.75、7.5、15 μM，每組9孔，分別孵育 24、48、72 h.每組及空白取3孔，加20 μL MTT溶液，孵育2 h.棄液，加200 μL DMSO及甘氨酸緩沖液25 μL.酶標儀讀取光密度，波長570 nm，記錄吸光值分別為 OD0、OD實驗、OD空白.計算抑制率 =［(OD0-OD空白)-(OD實驗-OD空白)］/(OD0-OD空白).

2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡和周期 待測細胞接種于6孔板.加濃度為IC50的實驗樣品2 mL，處理72 h.收集細胞，加體積分數(shù)70%的冰乙醇固定，4℃過夜，離心.PBS重懸，離心.加1 mL PI染液，4℃避光30 min.流式細胞儀分析PI熒光直方圖，收集數(shù)據(jù)，Mutlciyde軟件計算Gl期、S期和G2期細胞的相對比值.

2.4 Western blot檢測p53的表達 待測細胞用RIPA裂解液重懸、超聲、離心，收集蛋白樣品.測量總蛋白質量濃度:取蛋白樣品40 μg，用體積分數(shù)12%的分離膠溶液進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE);260 mA橫流濕轉90 min，體積分數(shù)5%脫脂牛奶封閉，一抗4℃過夜，PBS洗滌3次，二抗避光2 h，TBST洗滌2次.顯色液按照1∶1比例避光覆蓋PVDF膜，曝光顯影.

2.5 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析.各組均數(shù)采用方差分析與S-N-K檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義.

3 結果和結論

3.1 合成的西紅花糖苷對腫瘤細胞增殖的影響

表1 在不同濃度的SE作用下A549細胞系的生長抑制率Table 1 The proliferation inhibition rates of A549 with different concentration of SE

表2 濃度為15 μM的SE及合成的西紅花糖苷作用下A549細胞的生長抑制率Table 2 The proliferation inhibition of A549 using concentration of 15 μM SE or synthetic crocins

1)不同濃度的SE及合成的西紅花糖苷分別作用于8種腫瘤細胞株HCT116、HT-29、LOVO、SW620、SW480、A549、BELE-7402、MCF-7 不同時間.檢測其對細胞增殖的抑制作用，抑制率隨實驗樣品濃度及處理細胞時間的增加而增加，以SE作用于A549細胞為例，當濃度為0.937 5 μM時，細胞的生長和未處理組無明顯差異(P＞0.05)，而當濃度為15 μM時，處理組細胞生長受到抑制，24 h時抑制率為 0.377，48 h為 0.418 7，72 h時為0.422，即隨著時間的延長，其抑制率逐漸增加;當不同濃度的SE作用于A549細胞時，發(fā)現(xiàn)作用在相同的時間點上其抑制率隨SE濃度的增加而增加(表1).另外，與 SE 比較，crocetin、crocin I～III體外抑制腫瘤細胞增殖作用顯著，而crocin IV體外抑制作用與SE相當，crocin V～VIII抑制作用略遜于SE(表2).在相同濃度實驗樣品的作用下，A549細胞生長抑制率依次為crocin I、crocin II＞crocetin、crocin III＞crocin IV＞SE＞crocin V＞crocin VI＞crocin VIII＞crocin VII(圖2和表2).以上實驗說明，crocetin、crocin I～III體外抑制腫瘤增殖作用較SE更加明顯，crocin IV體外抑制作用與SE相當.

2)用相同濃度的SE及合成的西紅花糖苷作用于 8種腫瘤細胞株 HCT116、HT-29、LOVO、SW620、SW480、A549、BELE-7402、MCF-7 相同時間，觀察腫瘤細胞對其的敏感性.其中HCT116細胞對 crocetin、crocin I～crocin II的作用較為敏感，A549細胞對crocetin、crocin I～crocin IV作用較為敏感，BELE-7402細胞對crocin III的作用較為敏感，而SE、crocin V～crocin VIII作用于此8種腫瘤細胞均沒有較為敏感的菌株(圖3，其中“*”表示實驗樣品抑制該腫瘤細胞的增殖作用與其他腫瘤細胞比較具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)).因此以腫瘤抑制作用較為明顯的crocetin、crocin I～crocin IV作為觀察樣品組，用HCT116、A549作為靶細胞，進行抗腫瘤作用機制的相關研究.

3.2 合成的西紅花糖苷對細胞凋亡的影響 根據(jù)MTT實驗結果，應用流式細胞儀檢測合成的crocetin、crocin I～crocin IV 作用下 HCT116、A549細胞的凋亡(表3、圖4及5).與未處理的空白對照組比較，crocetin、crocin I和 crocin II可以誘導 HCT116細胞凋亡(圖4)，crocetin、crocin I和crocin IV則能促進A549細胞的凋亡(圖5).

3.3 合成的西紅花糖苷對細胞周期的影響 流式細胞儀檢測合成的crocetin、crocin I～crocin IV作用下HCT116、A549細胞有絲分裂周期的結果(表4和5).與空白對照組腫瘤細胞比較，在各自濃度為IC50的 crocetin、crocin I～crocin IV 的作用下，HCT-116、A549G2期的細胞比例明顯減少，G1/G2期細胞比例明顯增加，較多腫瘤細胞生長停滯在G1期.以上數(shù)據(jù)說明西紅花糖苷可能對腫瘤細胞分裂周期中相關蛋白質的合成具有抑制作用.

表3 HCT116、A549在合成的西紅花糖苷作用下的凋亡率Table 3 The apoptosis rates of HCT116 and A549 with synthesis crocins %

表4 HCT116在合成的西紅花糖苷作用下的細胞周期情況Table 4 The cell cycle process of HCT-116 with synthetic crocins %

表5 A549在合成的西紅花糖苷作用下的細胞周期情況Table 5 The cell cycle process of A549 with synthetic crocins %

3.4 合成的西紅花糖苷對p53基因表達的影響p53是對細胞周期和凋亡起關鍵作用的抑癌基因.本實驗給予濃度為IC50的SE及合成的西紅花糖苷藥物作用于HCT116、A549腫瘤細胞.Western blot檢測表明，與 SE比較，經(jīng)crocetin、crocin I～crocin IV處理后，p53基因表達明顯增加(圖6、圖7).因此，合成的西紅花糖苷誘導HCT116、A549細胞凋亡及細胞周期進程阻滯的機制可能與促進p53蛋白的表達有關.

4 討論

近年不少研究人員發(fā)現(xiàn)西紅花主要成分具有潛在的抗腫瘤活性，但諸多原因限制了西紅花的進一步研究及開發(fā).本實驗發(fā)現(xiàn)，與西紅花提取物SE比較，合成的crocetin、crocin I～crocin III在體外可以顯著抑制腫瘤細胞的增殖.另外，合成的西紅花糖苷能促進細胞凋亡，阻滯細胞于有絲分裂G1期，減少G2期腫瘤細胞的DNA合成;其抗腫瘤機制可能與上調p53表達相關.

SE中的主要成分有西紅花酸、西紅花素、西紅花酸二甲酯等，有降血脂、抗氧化、興奮子宮、活血等功效［7］.另外國內外實驗證明，西紅花提取物可在體內外抑制多種腫瘤細胞(如肝癌、腸癌、胃癌、前列腺癌、宮頸癌、乳腺癌等)［1-5，8］增殖，誘導細胞凋亡，阻滯細胞周期進程，抑制DNA和RNA合成.而在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要負性作用的主要物質是西紅花酸及西紅花糖苷［6］.本實驗中合成的西紅花糖苷具有相似的抗癌活性，且crocetin、crocetin I～III抑制細胞增殖作用優(yōu)于SE，該結果為替代SE，進一步研發(fā)抗癌新藥提供了理論依據(jù).

合成的西紅花糖苷作用于5種不同的大腸癌細胞，其敏感依次為:HCT116(p53野生型)＞LOVO(p53野生型)、HT-29(p53突變型)＞SW480、SW620(p53突變型);而西紅花糖苷調控HCT116細胞周期停滯在G1期，誘導細胞凋亡，同時p53的表達也有不同程度的上調.同樣，H.H.Aung等［9］也發(fā)現(xiàn)，在SE或提取的crocins作用下，HCT116的生長較SW480、HT-29受到明顯抑制.其機制為p53野生型及突變型腫瘤細胞分別通過p53依賴的及 p53 非依賴途徑激活 p21WAF1/Cip1［10-11］，后者抑制細胞周期依賴性激酶(CDKS)或生長增殖核抗原(PCNA)活性從而調控細胞周期于G1期.另外，研究表明SE可誘導兩種同源的HCT116(HCTp53陽性和HCTp53陰性)細胞凋亡及胞內DNA損傷，但死亡細胞碎片的自噬延遲誘導HCTp53陰性細胞凋亡［2］.因此，腫瘤細胞的p53狀態(tài)一定程度地影響著西紅花對其的細胞周期進程及細胞凋亡.但是否完全適用于合成的西紅花糖苷，以及其具體的機制等仍需進一步研究.

西紅花具有潛在的抗腫瘤活性，且對正常細胞的毒性很?。?，9］，是極有應用前景的抗癌藥物.而與SE比較，合成的西紅花糖苷用于腫瘤治療具有如下優(yōu)勢:1)量:目前，西紅花稀少，價格昂貴，有“植物黃金”之稱［12］;而化學合成可批量得到西紅花糖苷，成本低廉.2)理化性質:與SE比較，合成的西紅花糖苷成分單一，化學結構較簡單，理化性質清楚，藥物性能穩(wěn)定，有利于分析其各成分的作用.3)抗腫瘤活性:可以通過化學合成選擇抗癌活性顯著的藥物.本研究創(chuàng)新性地選擇出較SE具有更強體外抗腫瘤活性的合成的西紅花糖苷，并初步探討了其抗腫瘤機制，為探尋更理想的西紅花類抗腫瘤藥物提供了體外研究的依據(jù).

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