王 鈞, 鄔 卉，薛生國(guó),吳雪娥,劉 平

(1. 中南大學(xué)冶金與環(huán)境學(xué)院, 長(zhǎng)沙 410083; 2. 中國(guó)環(huán)境科學(xué)學(xué)會(huì), 北京 100082 )

錳脅迫對(duì)杠板歸細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

王 鈞1, 鄔 卉1，薛生國(guó)1,吳雪娥1,劉 平2,*

(1. 中南大學(xué)冶金與環(huán)境學(xué)院, 長(zhǎng)沙 410083; 2. 中國(guó)環(huán)境科學(xué)學(xué)會(huì), 北京 100082 )

錳是植物生長(zhǎng)必需的微量元素，然而錳含量過高將影響酶活性、造成植物毒害，不同植物的錳耐性差異很大。杠板歸(PolygonumperfoliatumL.)是一種生長(zhǎng)在錳尾礦廢棄地的耐性植物。通過溫室培養(yǎng)，應(yīng)用透射電子顯微鏡-能譜聯(lián)用儀研究不同錳處理?xiàng)l件下(5,1000,10 000 μmol/L)杠板歸根、莖和葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化和錳在葉細(xì)胞內(nèi)可能的存在形式，結(jié)果表明：(1)生長(zhǎng)介質(zhì)錳含量為5 μmol/L時(shí)，杠板歸細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)未見異常；即使錳處理濃度為1000 μmol/L時(shí)，杠板歸根、莖和葉細(xì)胞結(jié)構(gòu)依然完整，細(xì)胞器清晰可見，未見明顯損傷；(2)當(dāng)錳處理濃度為10000 μmol/L時(shí)，杠板歸細(xì)胞器未見缺失現(xiàn)象，但根細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量減少，莖細(xì)胞葉綠體開始受損，葉細(xì)胞葉綠體膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)破損，基粒片層結(jié)構(gòu)減少，嗜鋨顆粒數(shù)量明顯減少；(3)與對(duì)照相比，1000 μmol/L或10000 μmol/L錳處理30 d，植物細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)黑色團(tuán)聚物。10000 μmol/L錳處理?xiàng)l件下，杠板歸葉細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間隙出現(xiàn)類似針狀物質(zhì)，這可能是杠板歸體內(nèi)錳積累和分布的形態(tài)之一。研究成果有助于闡明植物的錳耐性機(jī)制，為錳耐性植物篩選和廢棄錳尾礦庫生態(tài)重建提供科學(xué)參考。

杠板歸; 錳脅迫; 耐性; 細(xì)胞; 超微結(jié)構(gòu)

植物對(duì)重金屬的耐性通常因植物種類和重金屬元素種類的不同而存在差異。重金屬在植物體內(nèi)的分布總是盡可能避免損傷具有重要功能的組織、細(xì)胞和細(xì)胞器，而重金屬在植物體內(nèi)的選擇性分布是植物忍耐重金屬毒害的重要機(jī)制之一[1- 2]；相應(yīng)地，重金屬進(jìn)入植物體后，通過損傷重要組織、細(xì)胞和細(xì)胞器來表現(xiàn)其毒性，影響植物生長(zhǎng)并可能導(dǎo)致植物體的死亡[3- 4]。植物細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(細(xì)胞器)的改變是植物一系列生理活動(dòng)異常的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[5]。植物細(xì)胞遭受重金屬脅迫后其超微結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生不同程度的損傷，主要表現(xiàn)在高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核、葉綠體、線粒體、液泡、質(zhì)膜等的異常變化。金偉等[6]用透射電鏡觀察 Cr3+處理18d的亞心形藻超微結(jié)構(gòu)的變化，低濃度 Cr3+(≤1.5×10-5mg/L)對(duì)細(xì)胞的傷害不明顯，Cr3+濃度增加時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞核變形，核膜解體，線粒體膨大或解體，類囊體缺失，排列紊亂，葉綠體膜系統(tǒng)潰解。Cu2+和Cd2+離子處理使泡泡草根細(xì)胞產(chǎn)生質(zhì)壁分離、細(xì)胞質(zhì)濃縮和部分細(xì)胞空泡，使線粒體脊突消失、結(jié)構(gòu)模糊和外膜破壞[7]。李大輝等[8]發(fā)現(xiàn)菱在 Cd2+、Hg2+處理8 d后，葉片和不定根細(xì)胞中細(xì)胞核的染色質(zhì)與核質(zhì)遭到破壞，不定根中細(xì)胞核的核仁消失。但核膜完整。梁文斌[9]等發(fā)現(xiàn)，低錳脅迫下垂序商陸葉細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化，隨著錳處理濃度的增加，葉綠體數(shù)目減少。

錳是植物生長(zhǎng)必需的微量元素之一，對(duì)植物的光合放氧、調(diào)節(jié)酶活性等方面具有不可替代的作用[10]。但是，過量的錳亦會(huì)對(duì)植物造成毒害[11]。錳對(duì)植物的毒性效應(yīng)最普遍的機(jī)制為氧化脅迫[12]。錳脅迫對(duì)不同植物細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)損傷既有相似性又有差異性，如豆長(zhǎng)明[13]等研究發(fā)現(xiàn)高錳脅迫下美洲商陸葉細(xì)胞葉綠體為主要損傷細(xì)胞器，葉細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量黑色團(tuán)狀顆粒，或液泡膜周邊出現(xiàn)大量黑色物質(zhì)；王華[14]等人研究發(fā)現(xiàn)在錳處理濃度≤5 000 μmol/L時(shí),水蓼葉細(xì)胞的細(xì)胞膜還沒有受到明顯傷害，錳在水蓼葉細(xì)胞非活性代謝部分(細(xì)胞壁和液泡)的積累是其解毒耐錳的主要機(jī)制之一；Ioannis Papadakis[15]等在觀察柑橘細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)，高錳脅迫下液泡中發(fā)現(xiàn)黑色物質(zhì)，且通過增加葉綠體數(shù)量和大小也適應(yīng)高錳脅迫環(huán)境；Snejana Doncheva[16]等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)錳處理濃度為3 000 μmol/L時(shí)，豌豆細(xì)胞葉綠體受損，類囊體扭曲，淀粉粒大小和數(shù)量上升，囊體中亦發(fā)現(xiàn)黑色物質(zhì)。

杠板歸(PolygonumperfoliatumL.)是在湖南湘潭發(fā)現(xiàn)的錳耐性植物，在錳含量高達(dá)114 000 mg/kg的廢棄尾礦庫上生長(zhǎng)良好[17]。研究發(fā)現(xiàn)，溫室條件下錳處理濃度為500 μmol/L時(shí)，杠板歸葉錳含量即達(dá)13140 mg/kg，當(dāng)錳濃度為10000 μmol/L時(shí)葉錳含量高達(dá)41 540 mg/kg。重金屬在植物體內(nèi)的積累超過一定閾值后，將對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的造成損傷。 植物受重金屬脅迫后，其細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變是植物一系列生理活動(dòng)異常的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，因此本文擬采用溫室營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)法，以杠板歸為研究對(duì)象，從亞細(xì)胞水平研究耐性植物在不同錳處理水平條件下細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，并探尋錳在細(xì)胞內(nèi)可能的積累位點(diǎn)，有助于闡明植物的錳耐性機(jī)制，為錳礦廢棄地耐性植物篩選和生態(tài)重建提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以杠板歸為研究對(duì)象，種子采自湖南湘潭錳礦。低溫處理和消毒后置于恒溫箱(溫度為(25+0.5)℃)催芽，待種子露白后埋入河沙盆中，長(zhǎng)到2葉1心時(shí)，選取生長(zhǎng)一致的健壯幼苗移栽至體積為20 L的塑料盆內(nèi)，采用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)[18]。設(shè)定3個(gè)錳處理水平，錳濃度分別為5、1000、10000 μmol/L，其中5 μmol/L是植物正常生長(zhǎng)需要的微量元素水平。錳以MnCl2·4H2O形態(tài)加入，每組處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)初期，營(yíng)養(yǎng)液每7 d換1次，旺盛生長(zhǎng)期每5 d換1次，每天用 0.1 mol/L NaOH或0.1 mol/L HCl調(diào)pH值至4.5，以維持生長(zhǎng)介質(zhì)中較高的Mn2+濃度，保持24 h通氣。連續(xù)處理30 d，收獲植物。

1.2 透射電子顯微鏡樣品制備與觀察

選取不同錳處理?xiàng)l件下杠板歸新鮮的根、莖和葉樣品，用鋒利的刀片將其切成大小約1—2 mm2的小塊，依次經(jīng)過2.5%的戊二醛溶液(0.2 mol/L PBS緩沖液配)固定、磷酸緩沖液(pH值=7.2的PBS)洗滌、1%的OsO4固定、0.1 mol/L的磷酸緩沖液(pH值=7.0)漂洗、梯度脫水、冷凍斷裂法分割樣品等，環(huán)氧樹脂對(duì)樣品進(jìn)行包埋滲透，經(jīng)70 ℃聚合48 h后儲(chǔ)存?zhèn)溆?。用超薄切片機(jī)將制備的樣品切成80 nm的薄片，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色后在JEOL TEM- 1230EX電鏡上觀察并照像，工作電壓為100 kV。

1.3 杠板歸葉片的能譜分析

將杠板歸葉片用鉆石刀在超薄切片機(jī)上切成120 nm的薄片，通過透射電鏡尋找樣品細(xì)胞中電子云密度小體分布位點(diǎn)，并拍照，用EDAX-PHOENIX 能譜分析儀進(jìn)行樣品的X射線光譜分析。能譜儀操作條件為：加速電壓80 kV，最小光斑直徑(Spotsize)80 nm，樣品臺(tái)傾角35 ℃，保持CPS(每秒所讀信息量)1500，收譜時(shí)間100 s。

2 結(jié)果與分析

2.1 錳對(duì)杠板歸根細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

圖1至圖3為錳耐性植物杠板歸在不同錳濃度處理下根細(xì)胞及細(xì)胞器的超微結(jié)構(gòu)變化。生長(zhǎng)介質(zhì)錳含量5 μmol/L是植物正常生長(zhǎng)需要的微量元素含量水平，杠板歸根細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)未見異常(圖1-A)。與正常生長(zhǎng)環(huán)境條件相比，錳脅迫條件下杠板歸根細(xì)胞未見明顯變化，細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完整，細(xì)胞膜和細(xì)胞器清晰可見，液泡完整(圖1-B、圖1-C)。

圖1 不同錳處理濃度下杠板歸根細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)Fig.1 Ultrastructure pictures of the root cells of P.perfoliatum under different manganese levelsA. 錳處理濃度為5 μmol/L(CK)；B. 錳處理濃度為1000 μmol/L；C. 錳處理濃度為10000 μmol/L

線粒體是植物細(xì)胞中普遍含有的細(xì)胞器，大小形狀不一，由內(nèi)外兩層膜組成，膜結(jié)構(gòu)有效地增加了酶分子附著的表面。線粒體的重要功能是進(jìn)行呼吸作用，是細(xì)胞中產(chǎn)生能量的場(chǎng)所，提供植物生命活動(dòng)所需的能量。細(xì)胞中線粒體的數(shù)目與細(xì)胞的生理狀態(tài)有關(guān)，代謝旺盛的細(xì)胞有較多的線粒體。5 μmol/L錳處理?xiàng)l件下線粒體內(nèi)、外膜、峭較為清晰可見(圖2-A)；1000 μmol/L錳處理?xiàng)l件下，杠板歸根細(xì)胞線粒體數(shù)量結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化(圖2-B)；但在10000 μmol/L錳處理?xiàng)l件下，線粒體數(shù)量明顯減少，部分線粒體嵴消失(圖2-C)，這表明在高錳處理?xiàng)l件下杠板歸生長(zhǎng)受到一定程度的抑制。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是分布在細(xì)胞質(zhì)中的膜層結(jié)構(gòu)，以各種形狀延伸，擴(kuò)展形成各種管、泡、腔交織的復(fù)雜網(wǎng)狀管道系統(tǒng)，主要功能是合成蛋白質(zhì)，也與脂類和糖類的合成關(guān)系密切。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的存在提供了細(xì)胞空間內(nèi)的支持骨架，增加了細(xì)胞的表面積，形成細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸和貯藏系統(tǒng)，使代謝活動(dòng)高效進(jìn)行。細(xì)胞發(fā)育過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量可能有很大變化，影響其變化的因素包括細(xì)胞的類型、年齡以及外部環(huán)境條件。細(xì)胞內(nèi)活躍的代謝活動(dòng)與大量的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量有關(guān)。由圖3-A、圖3-B、圖3-C對(duì)比可以看出，不同錳處理?xiàng)l件下，杠板歸根細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)清晰可見，未發(fā)生明顯數(shù)量結(jié)構(gòu)變化。

圖2 不同錳處理濃度下杠板歸根細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)(線粒體)Fig.2 Ultrastructure pictures of the root cells of P.perfoliatum under different manganese levels (Mitochondrion)

圖3 不同錳處理濃度下杠板歸根細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)(內(nèi)質(zhì)網(wǎng))Fig.3 Ultrastructure pictures of the root cells of P.perfoliatum under different manganese levels (Endoplasmic reticulum)

2.2 錳對(duì)杠板歸莖細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

重金屬對(duì)植物細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響研究主要集中在葉和根，對(duì)莖的研究較少。莖作為植物養(yǎng)分及水分輸送的營(yíng)養(yǎng)器官，也是植物體內(nèi)金屬元素遷移轉(zhuǎn)運(yùn)的重要途徑。圖4至圖6為杠板歸在不同錳濃度處理下莖細(xì)胞及細(xì)胞器的超微結(jié)構(gòu)變化。5 μmol/L和1000 μmol/L錳處理?xiàng)l件下杠板歸莖細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞壁均未出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，核膜完整，細(xì)胞器清晰可見(圖4-A、圖4-B)，但在10000 μmol/L錳處理?xiàng)l件下，根細(xì)胞核內(nèi)有多處色深，異染色質(zhì)與常染色質(zhì)分布不均勻，部分細(xì)胞的雙層膜已出現(xiàn)受損跡象(圖4-C)。線粒體中嵴的多少與細(xì)胞生理狀態(tài)有關(guān)，代謝旺盛的細(xì)胞有較密的嵴。與對(duì)照(圖5-A)相比，1000 μmol/L錳處理?xiàng)l件下，杠板歸莖細(xì)胞線粒體數(shù)量未發(fā)生變化(圖5-B)，但在10000 μmol/L錳處理?xiàng)l件下莖細(xì)胞的線粒體嵴數(shù)量減少變得稀疏(圖5-C)，這表明在高錳處理?xiàng)l件下杠板歸莖細(xì)胞生活力下降，線粒體活性降低。葉綠體是植物整個(gè)光合作用的功能單位，是光合作用的細(xì)胞器。5 μmol/L和1000 μmol/L錳處理?xiàng)l件下，莖細(xì)胞基粒類囊體與葉綠體長(zhǎng)軸方向平行，基粒片層排列整齊(圖6-A、圖6-B)，但在10000 μmol/L錳處理?xiàng)l件下莖細(xì)胞的葉綠體基粒片層模糊，基粒類囊體膨脹，基粒排列紊亂(圖6-C)，這可能與高錳脅迫有關(guān)，也可能是杠板歸莖部逐漸木質(zhì)化，葉綠體失去功能。

圖4 不同錳處理濃度下杠板歸莖細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)Fig.4 Ultrastructure pictures of the stem cells of P.perfoliatum under different manganese levels

圖5 不同錳處理濃度下杠板歸莖細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)(線粒體)Fig.5 Ultrastructure pictures of the stem cells of P.perfoliatum under different manganese levels (Mitochondrion)

圖6 不同錳處理濃度下杠板歸莖細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)(葉綠體)Fig.6 Ultrastructure pictures of the stem cells of P.perfoliatum under different manganese levels (Chloroplast)

2.3 錳對(duì)杠板歸葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

圖7至圖9為不同錳濃度處理下杠板歸葉細(xì)胞及細(xì)胞器的超微結(jié)構(gòu)變化。錳濃度為5 μmol/L時(shí)，葉細(xì)胞膜系統(tǒng)完整, 細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常，葉綠體仍保持正常形態(tài)，基粒、基質(zhì)片層排列整齊，線粒體形態(tài)規(guī)則，內(nèi)膜脊突豐富、結(jié)構(gòu)整齊，間質(zhì)濃密(圖7-A)。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，隨著錳處理濃度升高，葉細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化主要體現(xiàn)在液泡內(nèi)出現(xiàn)黑色物質(zhì)、葉綠體損傷等。如圖7-B與圖7-C所示，與對(duì)照相比，1000 μmol/L或10000 μmol/L錳處理30 d，細(xì)胞內(nèi)明顯出現(xiàn)黑色團(tuán)聚物。其中，錳處理濃度為10000 μmol/L時(shí)，在電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)杠板歸細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間隙開始出現(xiàn)針狀物質(zhì)(圖7-C)，這可能是錳在植物細(xì)胞內(nèi)的一種存式形式。如圖8-A所示，杠板歸正常對(duì)照葉綠體結(jié)構(gòu)清晰，雙層膜完整，基粒片層結(jié)構(gòu)排列整齊，內(nèi)含淀粉粒，并有嗜餓顆粒；1000 μmol/L錳處理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)葉綠體完好無損，與對(duì)照結(jié)構(gòu)一致，未見損傷(圖8-B)；而10000 μmol/L錳處理?xiàng)l件下，葉綠體出現(xiàn)明顯損傷，結(jié)構(gòu)不完整，雙層膜破裂或結(jié)構(gòu)消失，內(nèi)部基粒片層結(jié)構(gòu)紊亂，淀粉顆粒與對(duì)照相比明顯增大變多，而嗜鋨顆粒數(shù)量明顯減少(圖8-C)。另外，與對(duì)照(圖9-A)或低濃度錳處理(圖9-B)條件下(錳處理濃度為5 μmol/L和1000 μmol/L)相比，高濃度錳處理?xiàng)l件下(錳處理濃度為10000 μmol/L)杠板歸葉細(xì)胞線粒體出現(xiàn)明顯損傷，內(nèi)部結(jié)構(gòu)紊亂，嵴突結(jié)構(gòu)不明或消失(圖9-C)。

圖7 不同錳處理濃度下杠板歸葉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)Fig.7 Ultrastructure pictures of the leaf cells of P.perfoliatum under different manganese levels

圖8 不同錳處理濃度下杠板歸葉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)(葉綠體)Fig.8 Ultrastructure pictures of the leaf cells of P.perfoliatum under different manganese levels (Chloroplast)

2.4 杠板歸葉細(xì)胞內(nèi)的類似針狀物質(zhì)

考慮到杠板歸為錳耐性植物，其錳積累量可高達(dá)41 540 mg/kg。很容易產(chǎn)生一個(gè)問題，杠板歸是否以晶體形式存儲(chǔ)錳？透射電子顯微鏡觀察顯示，杠板歸葉細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間隙開始出現(xiàn)類似針狀物質(zhì)(圖10)，且類似針狀物質(zhì)所含錳量較高(圖11-A、圖11-B)，選擇位點(diǎn)1和2的類似針狀物質(zhì)分析后，發(fā)現(xiàn)其含有元素O、P、Mn等，初步推測(cè)錳可能與磷酸根基團(tuán)0結(jié)合。

圖9 不同錳處理濃度下杠板歸葉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)(線粒體)Fig.9 Ultrastructure pictures of the stem cells of P.perfoliatum under different manganese levels (Mitochondrion)

圖10 杠板歸葉細(xì)胞內(nèi)能譜點(diǎn)位分布圖Fig.10 Corresponding EDAX-spectra pictures of the leaf cells of P.perfoliatum點(diǎn)位1示細(xì)胞間隙針狀物質(zhì)；點(diǎn)位2示細(xì)胞質(zhì)內(nèi)針狀物質(zhì)

3 討論

錳是植物生長(zhǎng)必需的微量元素之一, 參與體內(nèi)重要的新陳代謝過程。錳含量過高, 將影響酶活性, 導(dǎo)致體內(nèi)積累過多的H2O2和多酚類物質(zhì), 使植物受到毒害。過量的Mn2+能夠抑制Fe2+和Mg2+等元素的吸收及活性, 導(dǎo)致葉綠體結(jié)構(gòu)破壞、葉綠素合成下降和光合速率降低。低錳處理?xiàng)l件下，杠板歸的葉綠體結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化。隨著生長(zhǎng)介質(zhì)中錳處理濃度的升高，葉綠體開始出現(xiàn)不同程度的變化，葉綠體雙層膜破裂或結(jié)構(gòu)消失，內(nèi)部基粒片層結(jié)構(gòu)紊亂，表明高濃度錳脅迫對(duì)杠板歸葉綠體結(jié)構(gòu)已產(chǎn)生明顯影響。Snejana Doncheva[16]等發(fā)現(xiàn)錳處理?xiàng)l件下，豌豆細(xì)胞葉綠體受損，類囊體扭曲，淀粉粒大小和數(shù)量明顯上升。這與本研究中杠板歸葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)受高錳脅迫影響的結(jié)果類似。但是，梁文斌[19]等人觀察到的垂序商陸隨著錳處理濃度的升高，淀粉粒減少變小、嗜鋨顆粒數(shù)增多，與本研究中杠板歸葉綠體淀粉粒大小和數(shù)量上升、嗜鋨顆粒數(shù)量明顯減少的結(jié)果存在差異。這可能是由于杠板歸未通過淀粉粒降解，合成更多的有機(jī)溶質(zhì)，調(diào)節(jié)滲透壓的機(jī)制來應(yīng)對(duì)錳毒。

植物通過細(xì)胞區(qū)隔化作用忍耐金屬毒害，重金屬在植物體內(nèi)以不具生物活性的解毒形式存在。已有研究表明[4,20]，杠板歸具有較強(qiáng)的錳耐性，錳在植物體內(nèi)可能以某種非生物活性的解毒形式存在。錳與其它重金屬元素不同，其可能存在于液泡、細(xì)胞壁、高爾基體和葉綠體片層結(jié)構(gòu)[21- 22]。王華[14]等研究發(fā)現(xiàn)在錳處理濃度≤5 000 μmol/L時(shí)水蓼錳積累在水蓼葉細(xì)胞非活性代謝部分(細(xì)胞壁和液泡)。本研究中發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，杠板歸葉細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化主要體現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)黑色物質(zhì)。Ioannis Papadakis[15]、Snejana Doncheva[16]、豆長(zhǎng)明[10]等人在植物細(xì)胞內(nèi)都觀察到類似黑色物質(zhì)，其中豆長(zhǎng)明分析美洲商陸葉細(xì)胞內(nèi)黑色物質(zhì)后，發(fā)現(xiàn)其為錳的氧化物。過量錳以氧化錳形式存在于植物葉細(xì)胞內(nèi)，文獻(xiàn)也多有報(bào)道，而大量的錳氧化物累積將導(dǎo)致植物葉片出現(xiàn)發(fā)暗、黃斑等癥狀[23- 24]，與前期研究中溫室營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)下杠板歸葉片褪綠等結(jié)論吻合[17]。推測(cè)葉細(xì)胞內(nèi)黑色物質(zhì)可能為錳的氧化物，其組成元素及含量有待進(jìn)一步確定。

細(xì)胞的生理代謝活動(dòng)主要在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行,一旦細(xì)胞質(zhì)受毒害收縮、干涸和消失,即細(xì)胞空泡化，則細(xì)胞生理代謝活動(dòng)停止,細(xì)胞將死亡。盡管杠板歸在錳處理濃度高達(dá)10000 μmol/L培養(yǎng)液中，線粒體和葉綠體受到一定的損傷，但并未發(fā)現(xiàn)任何空泡化細(xì)胞，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體結(jié)構(gòu)依然完好，發(fā)揮各自的功能，這表明杠板歸對(duì)高錳脅迫具有極強(qiáng)的耐性。透射電鏡觀察還發(fā)現(xiàn)，隨著錳處理濃度的升高，杠板歸葉細(xì)胞間隙和細(xì)胞內(nèi)開始出現(xiàn)類似針狀物質(zhì)，能譜分析針狀物質(zhì)發(fā)現(xiàn)P元素含量達(dá)到7.92%和11.46%，可能是杠板歸通過磷酸根對(duì)錳進(jìn)行固定或沉淀。磷酸根在植物重金屬耐性作用中扮演重要角色，其作用機(jī)制一直頗受關(guān)注[25]，磷酸鹽對(duì)錳及其它重金屬的沉積與固定效應(yīng)在研究中也有不少報(bào)道[26- 27]。關(guān)于杠板歸錳累積過程中，磷酸根的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

圖11 杠板歸葉細(xì)胞內(nèi)不同區(qū)域能譜圖Fig.11 Corresponding EDAX-spectra pictures of the leaf cells of P.perfoliatum in different region

4 結(jié)論

(1) 當(dāng)生長(zhǎng)介質(zhì)錳濃度為5 μmol/L和1000 μmol/L時(shí)，杠板歸根、莖和葉細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞器清晰可見，未見明顯損傷。

(2) 當(dāng)錳處理濃度為10000 μmol/L時(shí)，植物細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器未見缺失現(xiàn)象，但是細(xì)胞器已受傷害，杠板歸根細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量減少，莖細(xì)胞葉綠體開始受損，葉細(xì)胞葉綠體雙層膜破裂或結(jié)構(gòu)消失，內(nèi)部基粒片層結(jié)構(gòu)紊亂。

(3) 高錳生長(zhǎng)條件下，杠板歸葉細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間隙出現(xiàn)類似針狀物質(zhì)，這可能是杠板歸體內(nèi)積累錳并避免錳毒害的一種形式。

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Manganese stress on the ultrastructures of a manganese tolerant plant,PolygonumperfoliatumL.

WANG Jun1, WU Hui1, XUE Shengguo1, WU Xue′e1, LIU Ping2,*

1SchoolofMetallurgyandEnvironment,CentralSouthUniversity,Changsha410083,China2ChineseSocietyforEnvironmentalSciences,Beijing100082,China

Manganese (Mn), a typical heavy metal pollutant, is an essential trace element found in various concentrations in all tissues. Manganese is known to be taken up by soil, water, and plants. Mn-contaminated soils and waters are becoming an environmental concern following increased awareness of the need for environmental protection. Soil Mn in particular accumulates easily and cannot be removed naturally in great quantities. Plants exposed to excess Mn often suffer from Mn poisoning, which has many negative effects. In general, excess heavy metal concentrations can induce specific damage to the ultrastructure of plant cells; such damage is expressed primarily as abnormal changes to cell components including the Golgi body, endoplasmic reticulum, nucleus, chloroplast, mitochondria, vacuole, and plasma membrane. Moreover, the extent of damage imparted to cell ultrastructure by heavy metal toxicity increases with both exposure time and heavy metal concentration.

PolygonumperfoliatumL. is a Mn-tolerant plant that can grow on abandoned Mn tailings. Accordingly, it is thought to be promising for the revegetation of land formed from such tailings. Following hydroponic experiments in a greenhouse environment, transmission electron microscopy-energy dispersive spectroscopy (TEM-EDS) was used to investigate changes in the ultrastructure of root, stem, and leaf cells ofP.perfoliatumand to study variations in the form of Mn in leaf cells under various Mn concentrations (5, 1000, and 10000 μmol/L). The results demonstrate the following. (1) For an Mn concentration of 5 μmol/L, the ultrastructure ofP.perfoliatumwas clearly visible, without any obvious damage. The structures of the root, stem, and leaf cells ofP.perfoliatumremained intact, with clearly visible and seemingly undamaged organelles, when the Mn concentration was increased to 1000 μmol/L. (2) Organelles were still present at Mn concentrations greater than 1000 μmol/L. However, the number of mitochondria in the root cells decreased, the double-membrane system and cristae of mitochondria became dim, and the chloroplasts in stem cells began to exhibit signs of damage. Moreover, evidence of damage began to appear in chloroplast membrane structures of leaf cells, where the lamellar structure of grana was poorly developed and the number of osmiophilic granules decreased significantly. Although the chloroplasts and chloroplast membrane structures ofP.perfoliatumhad significant changes under heavy Mn stress, this species could still survive and grow. All these suggested thatP.perfoliatumhad an extraordinary tolerance to Mn. (3) Black agglomerations were observed in the cells after treatment with Mn concentrations of 1000 μmol/L or 10000 μmol/L for 30 days, with more agglomerations observed at higher Mn concentrations. Such features were not noted in the control experiments. For an Mn concentration of 10000 μmol/L, Mn existed as a solid acicular substance within leaf cells and intercellular spaces, possibly indicating a mechanism employed byP.perfoliatumto allow accumulation of Mn while avoiding poisoning. The present study has furthered understanding of the Mn tolerance mechanisms of plants and laid a scientific foundation for adopting tolerant plants for use in the revegetation of polluted soil over large areas. Thus, the results offer promise for further developments in the ecological restoration of Mn tailings wasteland.

PolygonumperfoliatumL.; manganese stress; tolerance; cell; ultrastructure

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(40771181)；國(guó)家公益性(環(huán)保)行業(yè)科研資助項(xiàng)目(200909065)

2013- 06- 12;

2013- 10- 25

10.5846/stxb201306121691

*通訊作者Corresponding author.E-mail: liup3000@163.com

王鈞, 鄔卉，薛生國(guó),吳雪娥,劉平.錳脅迫對(duì)杠板歸細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響.生態(tài)學(xué)報(bào),2014,34(4):798- 806.

Wang J, Wu H, Xue S G, Wu X E, Liu P.Manganese stress on the ultrastructures of a manganese tolerant plant,PolygonumperfoliatumL..Acta Ecologica Sinica,2014,34(4):798- 806.