鐘曉芝，段志良，郭江龍，李強，王思娜，李靜，林榮，文金生

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）為有 包膜的單股正鏈RNA病毒，其基因組編碼三個結(jié)構(gòu)蛋 白（C、E1和E2）和七個非結(jié)構(gòu)蛋白（P1、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b）[1]。HCV感染肝臟后引起急性丙型肝炎，可發(fā)展成慢性肝炎、肝硬化，甚至肝細(xì)胞癌。目前全球已有約1.7億丙型肝炎患者[2]。由于臨床上丙型肝炎治療效果不太理想，因而，研發(fā)有效的疫苗仍是目前HCV研究的重點和熱點。

有研究表明：HCV特異性抗體無保護作用，而活化的CD8+T細(xì)胞是控制HCV感染和清除細(xì)胞內(nèi)感染病毒的決定因素[3-4]。因此，能誘導(dǎo)特異性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)的CD8+T細(xì)胞表位肽疫苗是一種很有希望的候選疫苗。HLA-A的三種等位基因HLA-A*0201、A*1101和A*2402在不同種族人群中總百分率均大于90%[5]，因此由三種等位基因限制性表位組成的CD8+T細(xì)胞表位肽疫苗具有廣泛的人群覆蓋率。在前期研究中，我們課題組以及國外研究人員已鑒定出了大量HCV特異性HLA-A*0201限制性CD8+T細(xì)胞表位[6-9]，但HLA-A*1101及A*2402限制性細(xì)胞表位的報道則寥寥無幾。本研究擬鑒定HCV特異性HLA-A*1101和A*2402限制性CD8+T細(xì)胞表位，為研發(fā)具有廣泛人群覆蓋性的CD8+T細(xì)胞表位肽疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 未感染HCV的健康志愿者招募自溫州醫(yī)科大學(xué)在校研究生，HCV基因型1b感染者血液由瑞安市人民醫(yī)院檢驗科及溫州市中心血站提供，人淋巴細(xì)胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，人γ-干擾素（IFN-γ）酶聯(lián)免疫斑點（ELISPOT）試劑盒購自荷蘭U-CyTech公司，APC標(biāo)記抗人CD3、FITC標(biāo)記抗人CD8a和PE標(biāo)記抗人IFN-γ的流式單抗購自美國Biolegend公司，ELISPOT分析儀來自北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀來自美國BD bioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 候選CD8+T細(xì)胞表位的預(yù)測及其合成：基于HCV基因型1b（AF165064）的氨基酸序列，采用T細(xì)胞表位預(yù)測軟件SYFPEITHI（http://www.syfpeithi.de/Scripts/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm）預(yù)測HCV特異性HLA-A*1101及A*2402限制性候選CD8+T細(xì)胞表位[10-11]。選擇候選表位的標(biāo)準(zhǔn)如下：①候選表位具有較高的預(yù)測得分；②通過Blast檢索，候選表位在1b基因型中高度保守；③候選表位C-末端殘基是蛋白酶體裂解預(yù)測結(jié)果。FITC標(biāo)記的已報道HLA-A*1101限制性表位肽NS4b_147（GVAGALVAFK）[12]和FITC標(biāo)記的已報道HLA-A*2402限制性表位肽NS4b_49（FWAKHMWNF）[13]用作陽性表位肽。委托上海強耀生物科技有限公司合成候選表位肽及陽性表位肽（純度＞95%）。肽溶于PBS（1 mg/mL），儲存于-80 ℃。

1.2.2 永生化的HLA-A*1101陽性、A*2402陽性B細(xì)胞株的建立：設(shè)計擴增HLA-A*1101和A*2402的引物。在健康志愿者簽署了知情同意書后，抽取每人1 mL EDTA抗凝的外周靜脈血，采用DNA提取試劑盒提取DNA?；谏鲜鲆铮捎肞CR儀擴增HLA-A*1101和 A*2402，PCR產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳。采集HLAA*1101陽性、A*2402陽性者的10 mL EDTA抗凝外周靜脈血，采用人淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個核細(xì)胞（PBMCs），將PBMCs懸浮于RPMI-1640培養(yǎng)基中并置于細(xì)胞培養(yǎng)板孔中。傳代培養(yǎng)B95-8細(xì)胞（感染EB病毒的絨猴白細(xì)胞，其培養(yǎng)上清中含有大量具有轉(zhuǎn)化B細(xì)胞作用的EB病毒基因），將其培養(yǎng)上清加入PBMCs中誘導(dǎo)B細(xì)胞永生化[14]。

1.2.3 競爭性肽結(jié)合實驗：大量培養(yǎng)上述永生化的 HLA-A*1101陽性、A*2402陽性B細(xì)胞，收集細(xì)胞。用 枸櫞酸（0.131 mol/L枸櫞酸和0.061 mol/L磷酸氫 二鈉，pH 3.2）處理細(xì)胞90 s以洗脫表面HLA-A*1101、 A*2402分子肽結(jié)合凹槽中結(jié)合的肽[15]。細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌后分成以下管：陰性對照管（無肽），細(xì)胞在無候選表位肽和陽性表位肽的情況下于37 ℃孵育 6 h；實驗管，細(xì)胞中加入不同濃度（1μg/mL、10 μg/mL、100μg/mL）的候選表位肽和FITC標(biāo)記的HLA-A*1101限制性或A*2402限制性陽性表位肽（NS4b_147或NS4b_49，均為30μg/mL），于37 ℃孵 育6 h；陽性對照管，細(xì)胞同F(xiàn)ITC標(biāo)記陽性表位肽 （NS4b_147或NS4b_49，均為30μg/mL）于37 ℃孵育 6 h。采用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞平均熒光強度（MFI）。下述公式用于計算候選表位肽對陽性表位肽的百分抑制率（percentage inhibition，PI）。PI＞50%表示候選表位肽與HLA-A*1101或A*2402有高結(jié)合力。

1.2.4 ELISPOT檢測HCV感染者PBMCs中肽特異性分泌IFN-γ的細(xì)胞：6例HLA-A*1101陽性HCV-1b感染者和6例HLA-A*2402陽性HCV-1b感染者（ELISA-IgM試劑盒證實為HCV感染，HCV基因型特異性RT-PCR證實為HCV基因型1b感染[16]）來自瑞安市人民醫(yī)院檢驗科及溫州市中心血站，在研究對象簽署了知情同意書后，抽取每人10 mL EDTA抗凝的外周靜脈血。采用人淋巴細(xì)胞分離液分離PBMCs，用RPMI-1640培養(yǎng)基（含2 mmol/L L-谷氨酰胺，100 U/mL青霉素，100μg/mL鏈霉素和10%胎牛血清）懸浮PBMCs。ELISPOT實驗簡單過程如下：將1×105PBMCs（懸浮 于100 μL RPMI-1640培養(yǎng)液）加入人IFN-γ ELISPOT試劑盒（預(yù)包被的PVDF膜96孔板）每孔中，設(shè)置陰性對照孔（加PBMCs而不加多肽），多肽刺激孔（加PBMCs同時加入多肽，其終濃度為10μg/mL），每個處理因素均設(shè)置2孔。將ELISPOT板放于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去每孔細(xì)胞及液體，洗板4次后，每孔加入100μL生物素化抗IFN-γ的檢測抗體，于37 ℃培養(yǎng)1 h。棄去孔中液體，洗板4次后，每孔加入100μL辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的鏈酶親和素，于37 ℃培養(yǎng)1 h（避光）。棄去孔中液體，洗滌4次后，每孔加入100μL現(xiàn)配的ACE顯色液，于37 ℃反應(yīng)15～20 min（避光）。移除每孔中液體，用去離子水沖洗板。采用ELISPOT斑點分析儀對每孔斑點計數(shù)，一個斑點代表一個斑點形成細(xì)胞（SFC），斑點數(shù)表示為SFCs/1×105PBMCs。減去陰性對照孔斑點數(shù)后，肽刺激孔斑點數(shù)≥5 SFCs/1×105PBMCs時，結(jié)果判讀為陽性[17]。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色（ICS）檢測HCV感染者PBMCs中肽特異性IFN-γ+CD8+T細(xì)胞：5×105PBMCs（懸浮于500μL RPMI-1640營養(yǎng)液）加入EP管中，設(shè)置陰性對照管（無肽）和肽刺激管（多肽的終濃度為10μg/mL）。細(xì)胞管中加入布雷菲德菌素A（BFA）使其達(dá)到終濃度為10μg/mL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。PBS洗滌細(xì)胞后，采用4%的多聚甲醛于4 ℃固定20 min。PBS洗滌細(xì)胞后，采用1%皂素懸浮細(xì)胞，然后加入APC標(biāo)記抗人CD3、FITC標(biāo)記抗人CD8a和PE標(biāo)記抗人IFN-γ的單抗，避光于4 ℃孵育40 min。PBS洗滌細(xì)胞后，采用流式細(xì)胞儀檢測CD8+T細(xì)胞中IFN-γ+CD8+T細(xì)胞的百分率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計。數(shù)據(jù)用±s來表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 候選CD8+T細(xì)胞表位與HLA-A*1101、A*2402分子的結(jié)合實驗 根據(jù)SYEPEITHI預(yù)測結(jié)果，我們選擇了5條HLA-A*1101限制性候選表位[E1_61（SIPTTTIRR）、 NS3_609（ITLTHPITK）、NS2_165（VVFSDMETK）、NS3_ 351（GKAIPLEVIK）和NS5b_251（QVIRSLTER）]和3條HLA-A*2402限制性候選表位[NS3_373（KCDELASKL）、NS5b_382（YYLTRDPTI）和NS5b_451（TYSIEPLDL）]并委托多肽合成公司加以合成。液相色譜和質(zhì)譜結(jié)果均證實合成多肽為目的肽，肽的實際純度均＞95%。候選表位肽和陽性表位肽的詳細(xì)信息見表1。

2.2 永生化的HLA-A*1101陽性、A*2402陽性B細(xì)胞株的建立 擴增HLA-A*1101和A*2402的引物見表2。擴增A*1101的條件為：94 ℃ 4 min，30循環(huán)（94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min），72 ℃ 4 min。擴增A*2402的條件為：94 ℃ 4 min，15循環(huán)（94 ℃ 30 s，65 ℃ 1 min），30循環(huán)（94 ℃ 30 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 30 s），72 ℃ 5 min。A*1101和A*2402 的PCR產(chǎn)物大小分別為500 bp和557 bp，見圖1。圖2和圖3分別為HLA-A*1101和HLA-A*2402的PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果，Blasting檢索結(jié)果證實PCR產(chǎn)物序列與實際序列完全一致。圖4為PBMCs和永生化的B細(xì)胞株的圖片。PBMCs的細(xì)胞偏小，邊緣整齊，折光度好，無分裂生長能力。隨著B95-8細(xì)胞培養(yǎng)上清刺激PBMCs的時間不斷延長，細(xì)胞量減少，存活細(xì)胞的邊緣不整齊，細(xì)胞變大并呈現(xiàn)分裂生長趨勢。最后，細(xì)胞分裂迅速，呈團塊狀生長，經(jīng)過進(jìn)一步傳代培養(yǎng)后即建立了穩(wěn)定的永生化的B細(xì)胞株。最終，我們建立了HLA-A*1101陽性、A*2402陽性B細(xì)胞株。

表1 HCV特異性HLA-A*1101、A*2402限制性候選CD8+T細(xì)胞表位肽及陽性表位肽

表2 擴增HLA-A*1101和A*2402的引物

圖1 HLA-A*1101和HLA-A*2402的PCR擴增結(jié)果

2.3 競爭性肽結(jié)合實驗結(jié)果 基于上述建立的永生化的B細(xì)胞株，我們研究了候選表位肽與HLA分子的結(jié)合力。在5條HLA-A*1101限制性候選表位肽（E1_61、NS3_609、NS2_165、NS3_351和NS5b_251）中，NS3_609和NS2_165對陽性表位肽的PI與候選表位肽的濃度呈正比，當(dāng)肽濃度為100μg/mL時，NS3_609和NS2_165的PI均大于50%（分別為86.5%和76.4%）（見表1和圖5）。在3條HLA-A*2402限制性候選表位肽（NS3_373、NS5b_382和NS5b_451）中，NS3_373和NS5b_382對陽性表位肽的PI與候選表位肽的濃度呈正比，當(dāng)肽濃度為100μg/mL時，NS3_373和NS5b_382的PI均大于50%（分別為57.1%和57.8%）（見表1和圖6）。

圖2 HLA-A*1101的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果

圖3 HLA-A*2402的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果

圖4 正常的PBMCs和B95-8細(xì)胞上清刺激HLA-A*1101陽性PBMCs產(chǎn)生的永生化B細(xì)胞株

圖5 候選表位與HLA-A*1101分子的結(jié)合力

圖6 候選表位與HLA-A*2402分子的結(jié)合力

2.4 IFN-γELISPOT實驗 在6名HLA-A*1101陽性HCV感染者PBMCs中，NS3_609和NS2_165特異性分泌IFN-γ的細(xì)胞頻率分別為（14±4）SFCs/1×105PBMCs和（8±2）SFCs/1×105PBMCs（已減去陰性對照），均大于5 SFCs/1×105PBMCs；而在6名HLA-A*2402陽性HCV感染者PBMCs中，NS3_373和NS5b_382特異性分泌IFN-γ的細(xì)胞頻率分別為（12±5）SFCs/1×105PBMCs和（15±4）SFCs/1×105PBMCs（已減去陰性對照），均大于5 SFCs/1×105PBMCs；其他肽特異性IFN-γ的斑點數(shù)在減去陰性對照后均小于5 SFCs/1× 105PBMCs（見圖7）。

2.5 PBMCs中肽特異性IFN-γ+CD8+T細(xì)胞的水平 在6名HLA-A*1101陽性HCV感染者PBMCs中，NS3_609和NS2_165特異性IFN-γ+CD8+T細(xì)胞占總CD8+T細(xì)胞的百分率分別為0.12%±0.04%和0.06%±0.02%，與陰性對照比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而在6名HLA-A*2402陽性HCV感染者PBMCs中，NS3_373和NS5b_382特異性IFN-γ+CD8+T細(xì)胞占總CD8+T細(xì)胞的百分率分別為0.11%±0.03%和0.15%±0.05%，與陰性對照比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其他肽特異性IFN-γ+CD8+T細(xì)胞的百分率與陰性對照比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（見圖8）。

3 討論

大量研究證實：HCV感染機體產(chǎn)生的抗體對HCV沒有中和作用，而誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞可清除感染者體內(nèi)HCV[3-4，18-23]。由于天然HCV抗原含有不合理的表位組分，能夠誘導(dǎo)Th1/Th2平衡改變，免疫偏差或免疫顛覆，而使HCV逃避機體的免疫防御而持續(xù)存在于肝細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致感染慢性化、肝硬化或肝癌。因而，僅能誘發(fā)CD8+T細(xì)胞反應(yīng)的CD8+T細(xì)胞表位疫苗已成為目前HCV疫苗研究的新方向[24-25]。HLAA的常見等位基因A*0201、A*1101和A*2402在不同種族人群中具有極高的總百分率。在既往研究中，基于T2細(xì)胞株（表達(dá)HLA-A*0201分子，其肽結(jié)合凹槽中無肽），研究者們已鑒定出多條HLA-A*0201限制性CD8+T細(xì)胞表位[6-9]。然而，由于缺乏類似的細(xì)胞株，HLA-A*1101和A*2402限制性CD8+T細(xì)胞表位的鑒定受到了極大制約。

圖7 HCV感染者PBMCs中肽特異性分泌IFN-γ的細(xì)胞的水平

圖8 HCV感染者CD8+T細(xì)胞中肽特異性IFN-γ+CD8+T 細(xì)胞的百分比

我們前期在登革病毒和HCV中的研究表明：T細(xì)胞表位預(yù)測軟件預(yù)測結(jié)合體內(nèi)、外實驗驗證法是一種快捷、費用低廉的鑒定病毒T細(xì)胞表位的研究策略[8，26-27]。由于HCV-1b基因型感染者在HCV感染者中占極高比率[16]，在本研究中，我們基于1b基因型的氨基酸序列采用SYFPEITHI預(yù)測合成了5條HLAA*1101限制性候選表位肽和3條HLA-A*2402限制性候選表位肽。研究表明：低濃度的枸櫞酸可以洗脫細(xì)胞表面HLA分子肽結(jié)合凹槽中的肽，為后續(xù)研究候選表位肽與HLA的結(jié)合奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)[15]?；诖耍偁幮噪慕Y(jié)合實驗已成功用于檢測候選表位肽與HLA的結(jié)合力[15]。其基本原理為：首先采用枸櫞酸處理細(xì)胞（PBMCs或細(xì)胞株），然后將候選表位肽和FITC標(biāo)記的已報道的能與某種HLA等位基因分子結(jié)合的陽性表位肽同枸櫞酸處理的細(xì)胞共同孵育，最后采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞MFI并計算PI。候選表位肽與HLA-A*1101或A*2402結(jié)合力越強，則占據(jù)的HLA-A分子越多，而熒光素標(biāo)記的陽性表位肽結(jié)合的量就越少，因而細(xì)胞的MFI就越弱，PI則越高。因而，PI可用于反映候選表位肽與HLA分子的結(jié)合力。相對PBMCs而言，細(xì)胞表型單一并能穩(wěn)定表達(dá)HLA分子的細(xì)胞株能產(chǎn)生更穩(wěn)定和可靠的實驗結(jié)果。B95-8細(xì)胞是一種感染EB病毒的絨猴白細(xì)胞，實驗證實其培養(yǎng)上清可誘導(dǎo)某些B細(xì)胞永生化產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞株[14]。在本研究中，我們招募了近50例健康志愿者，最后建立了穩(wěn)定的HLA-A*1101陽性、HLA-A*2402陽性永生化B細(xì)胞株?；诮⒌腂細(xì)胞株，競爭性肽結(jié)合實驗結(jié)果證明了候選表位肽NS3_609和NS2_165與HLA-A*1101分子具有高結(jié)合力，NS3_373和NS5b_382則與HLA-A*2402具有高結(jié)合力。

研究表明：與HLA分子結(jié)合力高的候選表位肽不一定是真正的T細(xì)胞表位[28]。一種肽到底是不是真正的T細(xì)胞表位，不但取決于肽與HLA分子的結(jié)合力，還取決于肽是否為蛋白在人細(xì)胞內(nèi)被蛋白酶體裂解產(chǎn)物。而通過采用敏感的免疫學(xué)實驗檢測HCV感染者PBMCs中是否存在某種肽特異性分泌IFN-γ的細(xì)胞則可證實該肽是否為人蛋白酶體裂解結(jié)果。ELISPOT和ICS實驗是公認(rèn)的用于研究細(xì)胞免疫的最佳方法，原因是這兩種實驗具有極高的敏感性和可重復(fù)性，前者可以反映單細(xì)胞免疫水平，后者則可以確定細(xì)胞免疫的表型。因此，這兩種方法可以結(jié)合起來從單細(xì)胞水平研究細(xì)胞免疫反應(yīng)。在本研究中，我們同時使用ELISPOT和ICS兩種方法檢測肽刺激HCV感染者PBMCs后分泌IFN-γ的細(xì)胞的頻率以及表型。結(jié)果顯示，HLA-A*1101陽性HCV感染者PBMCs中存在NS3_609和NS2_165特異性能分泌IFN-γ的CD8+T細(xì)胞，HLA-A*2402陽性HCV感染者PBMCs中存在NS3_373和NS5b_382特異性能分泌IFN-γ的CD8+T細(xì)胞。證實NS3_609、NS2_165、NS3_373和NS5b_382均是HCV蛋白經(jīng)人細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體裂解后產(chǎn)生的，從而表明這4條肽為HCV特異性CD8+T細(xì)胞表位。

總之，本研究成功鑒定出了2條HCV特異性HLAA*1101限制性CD8+T細(xì)胞表位和2條HLA-A*2402限制性CD8+T細(xì)胞表位。本研究證實，將永生化的B細(xì)胞株和競爭性肽結(jié)合實驗結(jié)合起來是一種極好的檢測候選表位肽與HLA分子結(jié)合力的研究策略。在將來的研究中，我們將探討這些表位誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞能否殺傷HCV感染的靶細(xì)胞，對機體有無免疫保護效應(yīng)。