彭土生，楊啟君，余桂芳

三氧化二砷對HBx-Hep G2細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響

彭土生，楊啟君，余桂芳

目的探討三氧化二砷(As2O3)對HBx-Hep G2細胞體外黏附、侵襲、遷移能力的影響及其機制。方法慢病毒介導構(gòu)建HBx-Hep G2細胞模型，免疫細胞化學法檢測HBx蛋白表達，分別采用MTT法、Transwell小室檢測As2O3對HBx-Hep G2細胞黏附、遷移、侵襲能力的影響，免疫組化方法檢測As2O3作用前后HBx-Hep G2細胞CD44V6表達的改變。結(jié)果構(gòu)建后的HBx-Hep G2細胞呈現(xiàn)HBx陽性信號，主要分布于胞漿，無局部高濃度聚集。隨著As2O3作用時間的延長及濃度增加，HBx-Hep G2細胞對Matrigel的黏附能力也隨之增加；與作用前相比，As2O3作用后HBx-Hep G2細胞游走與穿透基底膜的能力明顯受抑制[(128±8)vs.(102±7)、(96±5)vs.(85±6)]個/HP(P<0.05)；與As2O3作用前比較，H-SCOKE及陰性表達率均下降[(3.75±0.55) vs.(2.54±0.68)、(92.65±4.86)% vs.(63.27±5.98)%]能抑制HBx-Hep G2細胞CD44v6的表達(P<0.05)。結(jié)論As2O3能抑制HBx-Hep G2細胞與細胞的黏附、遷移和侵襲能力，其抑制作用可能與CD44v6的表達下調(diào)有關(guān)。

肝癌；HBx-Hep G2細胞；三氧化二砷；黏附；侵襲；CD44拼接異構(gòu)體6

原發(fā)性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，大部分肝癌患者就診時已失去手術(shù)機會,且大部分肝癌患者有乙型肝炎病毒感染基礎(chǔ)，肝功能儲備能力差，影響化療藥物的應(yīng)用。研究證實，乙肝病毒X基因(hepatis B virus X gene,HBx)可參與肝細胞轉(zhuǎn)化、細胞凋亡調(diào)控、DNA修復等[1，2]；并可促進腫瘤血管增生，增加肝癌惡性程度，加速腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[3～5]。探討低毒有效化療藥物，抑制肝癌復發(fā)轉(zhuǎn)移可延長肝癌患者的生存期，改善其生活質(zhì)量。三氧化二砷(As2O3)應(yīng)用于白血病治療已有多年的歷史，研究證實其具有細胞毒作用以及促進腫瘤細胞凋亡、抑制細胞轉(zhuǎn)移等作用。余桂芳等[6]通過體外實驗證實As2O3可抑制人肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，但尚未對HBx相關(guān)人肝癌細胞(HBx-Hep G2)侵襲轉(zhuǎn)移能力影響進行研究。因此，探討其對HBx-Hep G2細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，對完善As2O3抗肝癌侵襲轉(zhuǎn)移治療可提供全面的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌Hep G2細胞株由廣州醫(yī)科大學微生物免疫教研室提供；24孔Transwell小室(孔徑8 μm)購自Costar公司；Matrigel及層黏連蛋白購自美國BD公司；反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒，大腸桿菌DH5α， HEK293細胞、Taq DNA聚合酶、dNTP、限制性內(nèi)切酶HindIII、EcoRI，T4 DNA連接酶，DNA marker均購自TaKaRa公司；慢病毒表達系統(tǒng)由東莞博捷生物科技公司提供；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco公司；嘌呤霉素購自Sigma公司；TRIzol，Alex568標記的山羊抗人IgG均購自Invitrogen公司；兔源抗HBx抗體以及變異型白細胞分化抗原(CD44v6抗體)購自武漢博士德生物科技公司，二抗檢測試劑盒購自上?；蚬?。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)： 人肝癌Hep G2細胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液中(含10%小牛血清，青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml)，在含5%CO2的37℃孵箱中培養(yǎng)。細胞呈貼壁狀態(tài)，每2～3天傳一代，全部實驗均用指數(shù)生長期細胞。

1.2.2 HBx-Hep G2細胞模型的建立： 應(yīng)用PCR從質(zhì)粒pIERES2-EGFP-HBV中擴增X基因片段，克隆至慢病毒載體pZac2.1，應(yīng)用PCR、酶切和測序鑒定正確后，經(jīng)病毒包裝，感染Hep G2細胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達細胞株，免疫組化鑒定HBx的表達，以證實HBx-Hep G2細胞HBx穩(wěn)定表達后將細胞分為2組，實驗組為As2O3組(0.25 μg/ml、0.5 pg/ml、1 μg/ml)，對照組為未用藥組，分別于30、60、90、120 min進行觀察。

1.2.3 HBx-Hep G2細胞對基底膜的黏附能力： 篩選出穩(wěn)定表達HBx蛋白的HBx-Hep G2細胞，給予不同濃度As2O3培養(yǎng)24 h后，用胰酶消化為單細胞懸液，臺盼藍染色后計數(shù)。Matrigel包被96孔板，2%BSA封閉。細胞懸液加入包被好的96孔板中，分別作用30、60、90、120 min后吸出培養(yǎng)液及未黏附的細胞，每孔加入5 mg/L的MTT 20 μl，用酶標儀于波長570 nm處測定各孔吸光度值(OD值)，以O(shè)D值代表黏附細胞數(shù)，按下列公式計算細胞黏附率：黏附率=(黏附前細胞的吸收值-黏附后細胞的吸收值)/ 黏附前細胞吸收值×100%。

1.2.4 HBx-Hep G2細胞侵襲及游走能力： 將Matrigel按上法稀釋后，每室100 μl均勻鋪于小室腔膜上，成膠后于小室濾膜下面均勻涂上5 μg層黏連蛋白，放進24孔板中，紫外線照射2 h。實驗前以預熱的無血清培養(yǎng)基37℃水化，90 mim后去除培養(yǎng)基，將經(jīng)0.5 μg/ml的As2O3作用24 h前后的單細胞懸液加入其中。孵育箱培養(yǎng)24 h；取出各組Transwell小室，酒精固定，HE染色，中性樹膠封片后光鏡下觀察5個視野穿膜細胞數(shù)，計算平均每個視野細胞。游走實驗與侵襲實驗相似，僅在Transwell小室腔上不鋪Matrigel。

1.2.5 HBx-HepG細胞CD44v6的表達： 細胞經(jīng)0.5 μg/ml的As2O3作用前及作用24 h后，按常規(guī)方法免疫細胞化學染色。CD44v6主要表達于細胞膜與細胞漿中，其陽性表達以細胞質(zhì)及質(zhì)膜出現(xiàn)明顯的黃棕色顆粒狀沉積為準。排除爬片邊沿細胞。10×10低倍鏡下隨機選取10個細胞分布均勻的視野，每視野10×20倍鏡下隨機計數(shù)50個細胞。按細胞著色強弱分為4個等級：無著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。按公式H-SCORE=∑Pi(i+1)(i=0，1，2，3；Pi表示評分為i的比例)計算爬片H-SCORE得分。該評分方法較具體、真實地從總體水平反映細胞內(nèi)蛋白表達的情況。陽性率=(淡黃色+棕黃色+棕褐色)細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

2 結(jié) 果

2.1 HBx蛋白表達 構(gòu)建后的HBx-Hep G2細胞，免疫組化染色后,幾乎所有細胞呈現(xiàn)HBx陽性信號, 主要分布于胞漿, 無局部高濃度聚集。圖1見封3。

2.2 HBx-Hep G2細胞黏附 隨著As2O3作用時間的延長，HBx-Hep G2細胞對Matrigel的黏附能力隨之增強；隨著As2O3作用濃度的增加，其抑制Matrigel黏附的能力也隨之加強，不同時間點之間及不同作用濃度之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 見表1。

表1 不同時間、不同濃度As2O3作用后HBx-Hep G2細胞對Martrigel黏附率的影響

2.3 穿透基底膜與遷移能力 與As2O3作用前比，As2O3作用后HBx-Hep G2細胞的侵襲與遷移能力(128±8)個/HP vs.(102±7)個/HP，(96±5)個/HP vs.(85±6)個/HP均下降(P<0.05)。

2.4 CD44v6在細胞的表達 As2O3作用前，按常規(guī)方法免疫細胞化學染色， CD44v6蛋白主要在胞膜與胞漿內(nèi)黃棕色顆粒沉積，H-SCORE為(3.75±0.55)，CD44v6在細胞的表達陽性率為(92.65±4.86)%，均高于As2O3作用后，H-SCORE為(2.54±0.68)，CD44v6在細胞的表達陽性率為(63.27±5.98)%(P<0.05)。圖2見封3。

3 討 論

原發(fā)性肝癌以其高度惡性、生長迅速、易于轉(zhuǎn)移復發(fā)為特征。復發(fā)轉(zhuǎn)移嚴重影響了肝癌患者的預后。肝癌的高度惡性、復發(fā)轉(zhuǎn)移特性與其特殊的發(fā)病機制有很大關(guān)系，多項研究表明乙型肝炎病毒的慢性感染與肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展具有十分密切的關(guān)系，90%的肝癌與乙型肝炎有關(guān)[7，8]。在乙型肝炎病毒中X基因與肝癌的發(fā)生發(fā)展更為密切。最近幾年國內(nèi)外均有研究發(fā)現(xiàn)，HBx基因的一個新功能——促進肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移，其具體作用可能通過其表達的HBx蛋白誘導肝癌細胞向運動表型轉(zhuǎn)化，包括細胞骨架重排，偽足形成，CD44表達上調(diào)或通過整合素β1提高肝癌細胞在基質(zhì)中的黏附和運動、通過轉(zhuǎn)錄因子NF-AT上調(diào)環(huán)氧合酶-2和膜型基質(zhì)金屬蛋白酶的表達以促進肝癌細胞對基質(zhì)的降解等作用，從而促進了肝癌細胞的侵襲與遷移[9～12]。

雖然局部治療對肝癌患者發(fā)揮了主要作用，其中經(jīng)肝動脈化療栓塞(TACE)成為中晚期肝癌治療的主要手段，然而多中心臨床隨機對照分析提示，術(shù)前TACE不能延長可切除肝癌患者的生存期，僅能延緩而不是阻斷肝癌發(fā)展，患者中位生存期最多延長至16個月,少數(shù)臨床觀察也發(fā)現(xiàn)經(jīng)肝動脈化療栓塞本身促進殘癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移；研究發(fā)現(xiàn)適度缺氧促進了肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，一定程度的栓塞可能加重了肝癌的復發(fā)轉(zhuǎn)移[13，14]。提示肝癌化療栓塞治療后輔以抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移有著重要的臨床意義。

肝癌由于特殊的發(fā)病基礎(chǔ)以及化療藥本身對肝臟的損傷作用，限制了常規(guī)化療藥物在肝癌治療上的運用，探討低毒的抗侵襲轉(zhuǎn)移藥，以便更好的較長時間治療顯得更有必要。As2O3作為一種抗腫瘤藥物運用于臨床有悠久的歷史，其具有促進腫瘤細胞凋亡與誘導細胞分化、抑制端粒酶作用，不少研究也證實As2O3具有抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用[15～18]，同時As2O3與常規(guī)順鉑等化療藥相比其毒副作用明顯減輕，因此有望作為一種抗肝腫瘤轉(zhuǎn)移藥物運用于臨床。

本文通過慢病毒介導構(gòu)建了能穩(wěn)定表達HBx蛋白的人肝癌細胞模型，并通過免疫組化法證實了HBx蛋白的穩(wěn)定表達。以穩(wěn)定表達HBx蛋白的HBx-Hep G2細胞為實驗對象，在既往As2O3抗肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的研究基礎(chǔ)上，針對臨床肝癌大部分與乙型肝炎病毒感染相關(guān)，構(gòu)建了HBx相關(guān)肝癌細胞模型，使實驗對象更接近臨床實際，進一步完善了As2O3的抗肝癌侵襲轉(zhuǎn)移作用研究。結(jié)果顯示，不同濃度的As2O3抑制了HBx相關(guān)人肝癌細胞對Matrigel的黏附，并隨著濃度的增加其抑制率越高。

更進一步的體外侵襲轉(zhuǎn)移實驗探討了As2O3對HBx相關(guān)人肝癌細胞穿透基底膜及遷移運動的影響。本實驗運用Transwell小室細胞培養(yǎng)模型，是綜合判斷腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力，分析腫瘤細胞黏附、降解和穿透移行能力及相互間聯(lián)系的最有效且較經(jīng)典的實驗方法，已廣泛應(yīng)用于腫瘤體外侵襲轉(zhuǎn)移能力的檢測。小室內(nèi)不鋪Matrigel基膜，可檢測腫瘤體外移行能力。實驗結(jié)果顯示As2O3作用后的HBx相關(guān)人肝癌細胞其穿透基底膜及遷移運動能力均受到抑制，證實了As2O3對HBx同樣具有抑制穿透基底膜及運動能力，為其臨床運用提供更強的實驗基礎(chǔ)。

對基底膜的黏附是腫瘤細胞實現(xiàn)侵襲轉(zhuǎn)移的第一步，黏附過程借助多種細胞因子參加，CD44是目前研究較多的一種細胞黏附分子。分化抗原CD44是存在于各種細胞表面的跨膜糖蛋白分子，根據(jù)外顯子的表達情況CD44分為標準型、上皮型、變異型3種，CD44v6是CD44眾多的亞型之一，大量的證據(jù)表明多種惡性腫瘤組織如肝癌、胃癌、結(jié)腸癌、肺癌等普通存在CD44v6表達失控，其高表達與多種惡性腫瘤的發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[19～21]。本實驗通過免疫細胞化學技術(shù)檢測了HBx-Hep G2細胞CD44v6的表達，提示CD44v6在HBx-Hep G2細胞中同樣呈強陽性表達。經(jīng)As2O3作用72 h后，CD44v6蛋白的表達明顯下降。已有體外實驗顯示CD44v6參與了癌細胞與基底膜主要成分Laminin和IV型膠原的黏附，其促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移可能與其促進腫瘤細胞與血管內(nèi)皮細胞、基底膜的黏附作用，同時提高了腫瘤細胞的遷移運動能力有關(guān)。本實驗也顯示經(jīng)As2O3作用后，HBx-Hep G2細胞中CD44v6表達下降，提示HBx-Hep G2細胞對基底膜的黏附抑制作用減弱、遷移運動能力下降可能與CD44v6的表達水平下降有關(guān)。本實驗結(jié)果提示As2O3對乙型肝炎病毒感染相關(guān)的肝癌患者可能同樣具有抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用，值得臨床進一步研究證實。

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EffectofarsenictrioxideoninvasionandmetastasisofHBx-HepG2cell

PENGTusheng,YANGQijun,YUGuifang.

DepartmentofHepatology,theFifthAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510700,China

ObjectiveTo evaluate the effect of arsenic trioxide (As2O3) on HBx-Hep G2cells in vitro adhesion, invasion and migration of its mechanism.MethodsHBx-Hep G2cell model were built by lentivirus-mediated, immunocytochemistry assay protein HBx, respectively, using the MTT assay , Transwell chamber detection As2O3's effect on HBx-Hep G2cell adhesion, migration, invasion ability was detected. The role of As2O3on HBx-Hep G2cells CD44V6 expression changes were detected by immunohistochemistry.ResultsAfter built, HBx-Hep G2cells showed positive HBx signals, mainly distributed in the cytoplasm, no local high concentration of aggregation. With the increase of As2O3to extend the role of time and concentration, HBx-Hep G2cells on matrigel adhesion capacity also increased; compared with the previous, after using of As2O3, HBx-Hep G2and penetrate the basement membrane of the cell migration was markedly inhibited [(128±8)vs.(102±7),(96±5)vs.(85±6)] /HP (P<0.05); compared with before As2O3effects, H-SCOKE rate and negative expression were decreased [(3.75±0.55)vs.(2.54±0.68),(92.65±4.86)%vs.(63.27±5.98)%].It can inhibit the expression of CD44v6 HBx-Hep G2(P<0.05).ConclusionAs2O3can inhibit HBx-Hep G2cell-cell adhesion, migration and invasion, and its inhibition may be associated with down-regulation of the expression of CD44v6.

Liver cancer;HBx-Hep G2;Arsenic trioxide;Adhesion;Invasion;CD44 splice isoforms 6

廣東省中醫(yī)藥強省科研項目(No.20132202)

510700 廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院肝病區(qū)

余桂芳，E-mail:yuguifang2004@163.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.05.021

2014-01-14)