周 琴， 姚 健, 朱健華， 于小紅， 盛紅?！?/p>

(南通大學 1附屬醫(yī)院心內科, 3醫(yī)學院組胚教研室，江蘇 南通 226001； 2南通市第二人民醫(yī)院內科，江蘇 南通 226002)

肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy,HCM)是年輕人和運動員猝死的首要原因，編碼肌小節(jié)結構蛋白的基因突變被認為是HCM的病因[1]。本實驗室前期通過對臨床確診的HCM患者外周血行基因突變篩查，發(fā)現(xiàn)了一例新的心肌鈣蛋白I (cardiac troponin I,cTnI)基因突變類型[2]，為第127號密碼子由GAT轉換為TAT，使編碼的天冬氨酸(aspartic acid, Asp)變?yōu)槔野彼?tyrosine,Tyr)，即cTnIAsp127Tyr突變。

為探討該突變對心肌肥大的影響及可能的機制，本實驗在前期構建大鼠cTnIAsp128Tyr突變(相當于人類Asp127Tyr突變)腺病毒載體的基礎上，以該病毒轉染心肌細胞，并采用鈣調神經磷酸酶(calcineurin, CaN)抑制劑環(huán)孢菌素A(cyclosporine A，CsA)或FK506干預，檢測心肌細胞肥大和CaN mRNA及活性變化，以探討該突變對心肌肥大的影響及CaN在cTnIAsp128Tyr突變致心肌肥大中的作用。

材 料 和 方 法

1 動物及主要試劑

新生1日齡的清潔級SD乳鼠由南通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。主要試劑：腺病毒純化試劑盒(Biomiga)；HEK293細胞(中國科學院上海細胞研究所細胞庫)；DMEM高糖培養(yǎng)液及胎牛血清(Gibco)；胰蛋白酶粉(BBI)；CsA、FK506和DMSO(Sigma)；real-time PCR試劑盒(Bioneer)；小鼠抗GAPDH單克隆抗體、羊抗CaN多克隆抗體及羊抗小鼠和兔抗羊Ⅱ抗(Santa Cruz)；CaN測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

2 方法

2.1擴增和純化重組腺病毒 培養(yǎng)HEK293細胞，待細胞鋪滿瓶底80%時，吸出舊培養(yǎng)基，加入稀釋后的病毒原液，培養(yǎng)3～5 d后，收集所有細胞至離心管中，于-80 ℃和37 ℃反復凍融3次，離心后收集上清按腺病毒純化試劑盒說明進行純化，采用TCID50法測定重組腺病毒滴度。

2.2心肌細胞培養(yǎng)及分組 胰蛋白酶消化法制備乳鼠心室肌細胞，以5×108/L密度將細胞接種于6孔板中。細胞分8組：(1) 空白對照組：除培養(yǎng)液外，無任何干預因素；(2) 陰性對照病毒轉染組：加入不含任何目的基因的腺病毒載體；(3) 野生型cTnI基因轉染組：給予攜帶正常cTnI基因的腺病毒干預；(4)突變型cTnI基因轉染組：用含cTnIAsp128Tyr突變基因的腺病毒干預；(5) 突變型cTnI基因轉染+CsA組：用含cTnIAsp128Tyr突變基因的腺病毒轉染同時給予CsA；(6) 突變型cTnI基因轉染+ FK506組：用含cTnIAsp128Tyr突變基因的腺病毒轉染同時給予FK506。

具體方法：原代乳鼠心肌細胞培養(yǎng)48 h后換無血清培養(yǎng)液，按實驗分組分別加入CsA或FK506，終濃度均為1 μmol/L。預處理30 min后，按實驗分組給予相應病毒干預(按預實驗確定的最適MOI 為200給予相應病毒量)，培養(yǎng)24 h后換液，繼續(xù)孵育48 h后留取細胞用于檢測。

2.3Real-time PCR法檢測心鈉素(atrial natriuretic factor，ANF)、腦鈉肽 (brain natriuretic peptide, BNP)和CaN mRNA表達 Trizol法提取細胞總RNA，按照兩步法進行反轉錄-聚合酶鏈反應， PCR條件：第1步，95 ℃ 3 min；第2步，95 ℃ 15 s，58 ℃ 25 s及72 ℃ 35 s，循環(huán)45次。引物序列如下：GAPDH正義鏈5′-CCATCACTGCCACTCAGAAGACT-3′，反義鏈5′-ACATTGGGGGTAGGAACACG-3′；ANF正義鏈5′-GAGCAGACCGATGAAGCG-3′，反義鏈5′-GAGCAGAGCCCTCAGTTTG-3′；BNP正義鏈5′-GCTCTCAAAGGACC AAGGC-3′，反義鏈5′-AAACAACCTCAGCCCGTCA-3′；CaN正義鏈5′-ATGACAG AAGGGGAAGACCAG-3′，反義鏈5′-TCCTCCAGCCAACACTCCA-3′。以GAPDH為內參照，采用2-ΔΔCt法進行相對定量，mRNA表達量以各樣本與空白對照組的倍數(shù)表示。

2.4CaN檢測試劑盒測定CaN活性 超聲波細胞粉碎機裂解細胞，離心后收集上清，BCA法測定蛋白濃度后，采用對硝基苯磷酸發(fā)色底物法，按照CaN測定試劑盒說明檢測CaN活性，結果以每毫克蛋白中所含的CaN活力單位表示[U/(mg protein)]。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS Statistics 17.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析及q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 乳鼠心肌細胞形態(tài)學觀察以及ANF和BNP mRNA表達的變化

乳鼠心肌細胞培養(yǎng)12 h基本貼壁，48 h后出現(xiàn)成片搏動。應用前期構建并擴增的綠色熒光蛋白標記的腺病毒感染心肌細胞10～12 h后，即可見細胞內表達綠色熒光蛋白。處理因素作用72 h 后, 熒光表達強烈。與轉染含正常cTnI基因的心肌細胞相比，轉染含突變cTnI基因的心肌細胞呈增大趨勢；突變型cTnI基因轉染合并CsA或FK506干預組的心肌細胞較突變型cTnI基因轉染的心肌細胞呈減小趨勢，見圖1。

Figure 1. The photographs of cardiomyocytes.A: blank control group; B: transfected with the control vector virus; C: transfected with the virus containing the wild-type cTnI gene; D: transfected with the virus containing the mutant cTnI gene; E: transfected with the virus containing the mutant cTnI gene plus CsA intervention; F: transfected with the virus containing the mutant cTnI gene plus FK506 intervention. Bar=50 μm.

對轉染72 h后的心肌細胞進行細胞肥大分子標志物ANF和BNP mRNA表達檢測發(fā)現(xiàn)：與空白對照組相比，陰性對照病毒轉染組(ANF：1.024±0.341;BNP： 1.004±0.273)、野生型cTnI基因轉染組(ANF：1.076±0.375;BNP：1.193±0.621)細胞內ANF和BNP mRNA表達無顯著差異(P>0.05)，提示無論病毒或正常肌鈣蛋白I轉染對心肌肥大分子標志物表達均無影響。與空白對照組、陰性對照病毒轉染組或野生型cTnI基因轉染組相比，轉染突變型cTnI基因的心肌細胞其ANF mRNA(2.390±1.022)和BNP mRNA(2.696±1.134)表達均顯著增高(P<0.05)，提示cTnIAsp128Tyr突變可引起心肌細胞肥大。ANF和BNP mRNA表達在突變型cTnI基因轉染+CsA干預(ANF：0.882±0.301；BNP：1.215±1.235)或突變型cTnI基因轉染+FK506干預(ANF：0.863±0.572；BNP：1.030±0.543)都較單純轉染突變型cTnI基因的心肌細胞顯著降低(P<0.05)，提示CsA或FK506可抑制心肌肥厚,見圖2。

Figure 2. The mRNA expression of ANF and BNP in the cardiomyocytes with different treatments. Control: blank control group; negative: transfected with the control vector virus; wild: transfected with the virus containing the wild-type cTnI; mutation: transfected with the virus containing the cTnI Asp128Tyr mutation; CsA: CsA+cTnI Asp128Tyr mutation; FK506: FK506+cTnI Asp128Tyr mutation.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control, negative or wild; #P<0.05 vs mutation.

2 不同處理對心肌細胞中CaN活性的影響

通過對各組心肌細胞中CaN活性的測定發(fā)現(xiàn)：空白對照組[(9.476±1.892) U/(mg protein)]、陰性對照病毒轉染組 [(13.683±2.265) U/(mg protein)] 及野生型cTnI基因轉染組 [(14.153±0.608) U/(mg protein)] 3組間CaN活性無顯著差異(P>0.05)，但與這3組相比，突變型cTnI基因轉染組 [(19.920±0.702) U/(mg protein)] 的心肌細胞中的CaN活性顯著增高(P<0.05)，突變型cTnI基因轉染+CsA干預 [(12.329±0.277) U/(mg protein)] 或突變型cTnI基因轉染+FK506干預 [(12.582±1.303) U/(mg protein)] 后CaN 活性較單純突變型cTnI基因轉染組顯著下降(P<0.05)。

3 不同處理對心肌細胞中CaN mRNA表達的影響

空白對照組、陰性對照病毒轉染組(0.938±0.365)及野生型cTnI基因轉染組(1.054±0.521)3組間的CaN mRNA表達水平相近(P>0.05)；與這3組相比，突變型cTnI基因轉染組的心肌細胞中CaN mRNA表達(1.722±0.606)顯著升高(P<0.05)；突變型cTnI基因轉染+CsA干預組(0.975±0.351)或突變型cTnI基因轉染+FK506干預組(0.955±0.239)的CaN mRNA表達較突變病毒轉染組下降(P<0.05)，見圖3。

Figure 3. The mRNA expression of CaN in the cardiomyocytes with different treatments. Control: blank control group; negative: transfected with the negative control vector virus; wild: transfected with the virus containing the wild-type cTnI; mutation: transfected with the virus containing the cTnI Asp128Tyr mutation; CsA: CsA+cTnI Asp128Tyr mutation; FK506: FK506+ cTnI Asp128Tyr mutation.Mean±SD.n=6. *P<0.05 vs control, negative or wild; #P<0.05 vs mutation.

討 論

肥厚型心肌病是一種以常染色體顯性遺傳為特征的具有遺傳異質性的心臟疾病[1]，臨床表現(xiàn)可從無癥狀到黑矇、暈厥、心絞痛、心衰甚至猝死。近年研究認為HCM是一種心肌肌小節(jié)基因相關疾病, 編碼肌小節(jié)蛋白基因中的1個基因突變即可致病[3]。為探討前期在肥厚型心肌病患者中新發(fā)現(xiàn)的cTnIAsp127Tyr突變是否可致心肌肥大及其可能的機制，我們構建了含大鼠cTnIAsp128Tyr突變的腺病毒載體，以該病毒轉染培養(yǎng)的心肌細胞，觀察心肌細胞中肥大基因表達的變化，并以CaN抑制劑CsA或FK506干預，探討CaN在cTnIAsp128Tyr突變致心肌肥大中的作用。

為了排除突變病毒轉染過程中腺病毒或肌鈣蛋白轉染對心肌肥大可能的影響，我們在設置空白對照組(不加任何干預因素)的同時，設置了不含任何目的基因的單純腺病毒組(陰性對照病毒轉染組)和攜帶正常cTnI基因的腺病毒組(野生型cTnI基因轉染組)作為對照。實驗發(fā)現(xiàn)：與空白對照組相比，陰性對照病毒轉染組或野生型cTnI基因轉染組的ANF和BNP mRNA表達量的均無顯著差異，提示單純腺病毒或肌鈣蛋白轉染對心肌細胞肥大均無影響。與空白對照組、陰性對照病毒轉染組或野生型cTnI基因轉染組相比，用含cTnIAsp128Tyr突變基因的腺病毒轉染心肌細胞(突變型cTnI基因轉染組)可上調其ANF和BNP mRNA的表達，突變型cTnI基因轉染組的心肌細胞較野生型cTnI基因轉染組的心肌細胞具增大趨勢。實驗采用細胞培養(yǎng)方法證實了cTnIAsp128Tyr突變可導致心肌細胞肥大，與臨床攜帶該突變的患者表現(xiàn)為肥厚型心肌病相一致[2]。

近年研究發(fā)現(xiàn)：CaN作為唯一的鈣/鈣調素活化的蛋白磷酸酶，在離體細胞培養(yǎng)和在體壓力負荷增加等多種原因[4-7]導致的心肌肥大中發(fā)揮重要作用。但CaN在基因突變致肥厚型心肌病中的作用尚未獲定論。肌肉細胞特異性泛素蛋白連接酶1、肌球蛋白重鏈等基因突變致小鼠肥厚型心肌病模型中存在CaN活化[8-9]，但myozenin 2突變致肥厚型心肌病的心肌肥厚過程則不依賴于CaN信號通路的活化[10]。為探討CaN在cTnIAsp128Tyr突變中的作用，本實驗對病毒轉染的心肌細胞進行了CaN活性測定并觀察CaN抑制劑CsA或FK506對心肌細胞肥大的影響。實驗發(fā)現(xiàn)：與空白對照組、陰性對照病毒轉染組或野生型cTnI基因轉染組相比，轉染了cTnIAsp128Tyr突變基因的心肌細胞在細胞增大、心肌肥厚分子標志物ANF和BNP mRNA表達上調同時，細胞內的CaN活性顯著升高；用CaN抑制劑CsA或FK506干預在降低CaN活性同時，大鼠心肌細胞縮小，胞內ANF和BNP mRNA表達下調，提示CaN信號通路參與了cTnIAsp128Tyr突變致心肌肥大過程。

CaN作為一種酶，既往的研究主要是檢測其活性水平的變化，本實驗中，我們在進行心肌細胞內CaN活性檢測的同時，進行了mRNA表達水平的測定。實驗發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，陰性對照病毒轉染組或野生型cTnI基因轉染組的CaN mRNA表達量均無顯著差異。與空白對照組、陰性對照病毒轉染組或野生型cTnI基因轉染組相比，轉染了cTnIAsp128Tyr突變基因的心肌細胞在CaN活性增高同時，還存在胞內CaN mRNA的表達量增加。用CaN抑制劑CsA或FK506干預在降低CaN活性、抑制心肌肥大的同時，CaN mRNA表達下調，提示在cTnIAsp128Tyr突變病毒轉染致心肌肥大過程中，不僅存在CaN活性水平的變化，還存在mRNA水平的調節(jié)。

除CaN外，尚有多條胞內信號通路參與了心肌肥厚的發(fā)生和發(fā)展：如蛋白激酶C[11]、絲裂素活化蛋白激酶通路包括胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)和p38等[12-14]，且多條通路間?；ハ鄥f(xié)調、制約，共同調控心肌肥厚反應[13-14]。ERK和JNK信號通路參與了myozenin 2突變所致肥厚型心肌病的心肌肥厚[10]，ERK還參與了Raf1L613V基因突變導致Noonan 綜合癥的心肌肥厚[15]。本實驗中我們主要探討了CaN在cTnIAsp128Tyr突變致心肌肥大中的作用，今后我們將進一步探討其它胞內信號通路在該突變中的作用。

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