王 哲， 劉曉玉， 張殿寶， 王秋實△

(1中國醫(yī)科大學盛京醫(yī)院輸血科，遼寧 沈陽 110004； 2中國醫(yī)科大學細胞生物學衛(wèi)生部重點實驗室，干細胞與再生醫(yī)學研究室，遼寧 沈陽 110001)

糖尿病動物和病人血中晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycosylation end products，AGEs)含量明顯升高，并伴有間充質(zhì)干細胞功能的損傷[1-2]。人脂肪間充質(zhì)干細胞(human adipose-derived stem cells，hADSCs)是一種來源于脂肪組織的間充質(zhì)干細胞，動物和臨床試驗均已經(jīng)證實hADSCs對糖尿病患者皮膚潰瘍愈合有明顯的促進作用[3]。hADSCs一方面通過自身的增殖、遷移和分化來修復創(chuàng)面；另一方面通過分泌多種生長因子，如血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)等來調(diào)節(jié)創(chuàng)面周圍細胞功能[4-5]。盡管自體hADSCs治療皮膚潰瘍?nèi)〉昧撕芎玫男Ч?，但是一些研究中仍然發(fā)現(xiàn)由于hADSCs功能損傷導致糖尿病患者皮膚潰瘍愈合不良[6-7]。本研究擬用含晚期糖基化終產(chǎn)物修飾的牛血清白蛋白(advanced glycosylation end product-bovine serum albumin，AGE-BSA)的培養(yǎng)基對hADSCs培養(yǎng)，通過對干細胞增殖和遷移能力及多種生長因子的檢測，探討AGEs對hADSCs生物學功能的影響，為臨床上提高自體干細胞移植治療糖尿病皮膚潰瘍后供體干細胞的功能提供新的依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 主要材料與試劑

中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院整形外科在無菌條件下取健康成人脂肪組織(經(jīng)醫(yī)院倫理委員會許可和患者同意)100 g；胎牛血清和胰蛋白酶(Gibco)；FITC 標記的抗CD34、CD45、CD90和CD105抗體(BD)；小牛血清白蛋白和葡萄糖(Sigma)；人纖維連接蛋白 (Roche)；人間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基以及成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞誘導分化培養(yǎng)基 (Stem Cell Technology)；WST細胞生長檢測試劑盒(日本株氏會社同仁化學研究所)；生長因子檢測試劑盒(R&D)。

2 方法

2.1hADSCs分離與培養(yǎng) 除血管、筋膜的脂肪組織置于平皿中，PBS洗3次后剪碎，加入2倍體積膠原蛋白酶Ⅰ，37 ℃消化60 min，終止消化后于細胞篩上過濾，1 500 r/min離心5 min收集細胞后以2×108/L的濃度接種于培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，記為P0。根據(jù)細胞貼壁情況，1～2 d全量換液1次。待細胞增殖達80%～90%時，按1∶3的比例傳代記為P1。

2.2hADSCs的鑒定 流式細胞術檢測 FITC 標記的間充質(zhì)干細胞表面標志物CD105、CD90、CD34、CD45 等特異性抗體。

2.3誘導hADSCs向成骨細胞、軟骨細胞或脂肪細胞分化及鑒定 誘導第3代分離培養(yǎng)的hADSCs向成骨細胞、軟骨細胞或脂肪細胞分化，培養(yǎng)21 d 后進行鑒定，具體方法參照文獻[8-9]。

2.4AGE-BSA的制備與分組 將小牛血清白蛋白50 g/L與0.5 mmol/L葡萄糖溶于磷酸鹽緩沖液中，室溫放置過夜，對照組中不含葡萄糖，其余條件一致。過濾除菌后置37 ℃避光孵育3個月。實驗前置于透析膜中，去除未結合的葡萄糖。熒光光譜掃描檢測AGE-BSA。將第3代貼壁培養(yǎng)的hADSCs分為BSA對照組、低濃度(50 mg/L)AGE-BSA作用組和高濃度(100 mg/L)AGE-BSA作用組。

2.5增殖能力檢測(WST法) 各實驗組分12 h、1 d、2 d、3 d和4 d時點進行增殖能力檢測。實驗終止前2 h向各組細胞 每孔中加入CKK-8 試劑20 μL, 培養(yǎng)結束時以酶標儀檢測吸光度 (A450值)。

2.6遷移能力檢測 各實驗組12 h、24 h和36 h時點進行遷移能力檢測。將 25 μL培養(yǎng)液和AGE-BSA (50 mg/L或100 mg/L) 加入改良的 Boyden Chamber 的下室，蓋上濾膜和趨化小室的上室；將含 2×104個hADSCs 50 μL 培養(yǎng)液注入上室， 蓋以載玻片；放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h；刮去濾膜上面的未移動細胞，用 4%多聚甲醛固定濾膜，Giemsa 染色，蒸餾水沖洗，干后鏡檢，隨機選擇 3 個顯微鏡視野 (×400) 計數(shù)遷移到低層的細胞數(shù)。

2.7ELISA測定 各實驗組12 h、24 h和36 h時點進行生長因子蛋白含量檢測。采用ELISA 測定各組細胞培養(yǎng)上清液蛋白含量。嚴格按照試劑說明書進行操作，酶標儀測定450 nm處的吸光度，根據(jù)標準曲線分別計算樣品中和含量。

2.8實時定量PCR檢測 VEGF-A上游引物5’-AGGGCAGAATCATCACGAAGT-3’,下游引物5’-AGGGTCTCGATTGGATGGCA-3’。HGF上游引物5’-GCTATCGGGGTAAAGACCTACA-3’，下游引物5’-CGTAGCGTACCTCTGGATTGC-3’。IGF-1上游引物5’-CCACCTACGAGAAGTCAAGC-3’，下游引物5’-CGACTATGAAGACCCAGAAC-3’。內(nèi)參照GAPDH上游引物5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游引物列5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。取各實驗組12 h、24 h和36 h時點細胞，抽提總RNA，按照Trizol試劑盒說明操作；反轉(zhuǎn)錄形成cDNA，按試劑說明配制10 μL逆轉(zhuǎn)錄體系，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s；實時熒光定量PCR,按照試劑說明配制20 μL PCR反應體系，反應條件為：預變性95 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，61 ℃ 34 s，共40個循環(huán)。Ct值表示目標擴增產(chǎn)物達到設定閾值經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。參考文獻[10]計算ΔΔCt，采用相對定量法計算各組2-ΔΔCt。

3 統(tǒng)計學處理

實驗重復3次以上，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，利用SPSS 17.0 軟件進行單因素之差分析和SNK-q檢驗， 以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 hADSCs培養(yǎng)與鑒定

原代hADSCs培養(yǎng)1 d后換液，部分細胞開始貼壁(圖1A)。培養(yǎng)3～4 d貼壁細胞呈紡錘形，隨后細胞開始集落生長(圖1B)。細胞形態(tài)較均一，呈放射狀排列，伸出長短不一、粗細不均的突起，核漿比例大。原代細胞大約10～12 d后鋪滿瓶底 80%(圖1C), 即可消化傳代，傳代培養(yǎng)的細胞可在48 h 之內(nèi)貼壁，呈長梭形、不規(guī)則形，生長旺盛，形成典型的 “漩渦狀”形態(tài)，伴有突起，較原代細胞扁平，核較大，呈橢圓形，核仁明顯，核漿比例大，6 d可鋪滿瓶底 80%，前期細胞傳代過程中混雜大量其它類型細胞，通過 3 次傳代可逐漸純化hADSCs。第4代細胞的MSCs表面標志CD90陽性率為96.25%±1.58%，CD34陽性率為 1.11%±0.34%，CD105陽性率為 96.97%±1.53%，CD45陽性率為1.29%±0.97%，表明本次獲得細胞為hADSCs，見圖2。

Figure 1. Morphological feature of hADSCs under phase-contrast microscope (×200)．A: 1 d; B: 3 d; C: 10 d．

2 hADSCs向成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞分化的能力

hADSCs經(jīng)成骨誘導21 d細胞內(nèi)有明顯礦物質(zhì)沉積，四唑硝基藍染色可見藍紫色礦化結節(jié)；hADSCs經(jīng)成軟骨誘導22 d，艾茜藍染色可見藍色的軟骨細胞；hADSCs經(jīng)成脂肪誘導14 d，鏡下細胞可見明顯脂滴，經(jīng)油紅O染色脂滴呈紅色，見圖3。

Figure 2. Flow cytometric analysis of the hADSCs showed that CD90+ and CD105+ cells were the highest population.

Figure 3. The differentiation of hADSCs into osteoblasts, chondrocytes and lipoblasts (×200) . A: hADSCs differentiated to osteoblasts after culture with osteogenic medium, as detected by alkaline phosphatase staining; B: hADSCs differentiated to chondrocytes after culture with chondrogenic medium, as detected by Alcian blue staining; C: hADSCs differentiated to adipose cells after culture with adipogenic medium, as detected by oil red O staining.

3 AGE-BSA對hADSCs增殖的影響

與BSA對照組比較，50 mg/L和100 mg/L AGE-BSA作用12 h、1 d、2 d、3 d和4 d后，hADSCs增殖能力明顯降低(P<0.05)，呈現(xiàn)濃度依賴效應，見表1。

4 AGE-BSA對hADSCs遷移的影響

與BSA對照組比較，50 mg/L和100 mg/L AGE-BSA作用hADSCs 24 h和36 h后， hADSCs遷移細胞數(shù)明顯降低(P<0.05)，呈現(xiàn)濃度依賴效應，見圖4。

5 AGE-BSA對hADSCs分泌 VEGF、HGF和IGF-1蛋白的影響

與BSA對照組比較，50 mg/L和100 mg/L AGE-BSA作用36 h，hADSCs培養(yǎng)液中的hADSCs分泌VEGF、HGF和IGF-1蛋白濃度明顯降低(P<0.05)，呈現(xiàn)濃度依賴效應，見表2。

表1 AGE-BSA對hADSCs增殖的影響

Figure 4. The effect of AGE-BSA on the migration of hADSCs with different treatments at different time points.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control; #P<0.05 vs low dose of AGE-BSA.

表2 AGE-BSA對hADSCs分泌 VEGF、HGF和IGF-1蛋白的影響

6 AGE-BSA對hADSCs VEGF、HGF和IGF-1 mRNA表達的影響

與BSA對照組比較，AGE-BSA作用12 h、 24 h和36 h后，hADSCs VEGF、HGF和IGF-1 mRNA水平明顯降低(P<0.05), 呈現(xiàn)濃度依賴效應，見圖5。

Figure 5. The mRNA expression of VEGF (A), HGF (B) and IGF-1 (C) in the hADSCs of each group detected by real-time PCR.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control; #P<0.05 vs low dose of AGE-BSA.

討 論

hADSCs作為一種成體間充質(zhì)干細胞群，由于其無倫理問題，來源廣泛，易獲得，易擴增，目前已成為糖尿病患者細胞移植和基因治療的有效載體[3-4]。本實驗采用膠原蛋白酶消化和差速貼壁法分離培養(yǎng)hADSCs，并對其生物學特性進行初步觀察，結果發(fā)現(xiàn)hADSCs與骨髓等其它組織來源的MSCs具有相似的特征，hADSCs高表達CD90和CD105，不表達CD34和CD45；在不同的誘導條件下被成功誘導分化為成骨、軟骨和脂肪細胞，證實其具有多種分化潛能。

糖尿病皮膚潰瘍是糖尿病嚴重慢性并發(fā)癥，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。盡管自體hADSCs治療皮膚潰瘍?nèi)〉昧撕芎玫男Ч?，但是一些研究中仍然發(fā)現(xiàn)由于hADSCs功能損傷導致糖尿病患者皮膚潰瘍愈合不良。血清AGEs 水平在高齡、動脈粥樣硬化和糖尿病患者中顯著升高[1-2], 患者體內(nèi)高濃度的AGEs對hADSCs增殖和遷移可能起到了一定的抑制作用。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)AGEs能促進內(nèi)皮細胞和臍血間充質(zhì)干細胞生成ROS, 抑制抗氧化酶生成，增強氧化應激，破壞細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性，從而影響內(nèi)皮細胞和臍血間充質(zhì)干細胞生物學功能[11-12]。最近的研究也證實AGEs 對內(nèi)皮祖細胞數(shù)量和功能也一定有影響[13-14]。本研究中我們通過對AGE-BSA 刺激后的hADSCs增殖和遷移能力檢測，結果表明AGE-BSA能損傷hADSCs增殖和遷移潛能，從而影響hADSCs修復創(chuàng)傷的功能。

hADSCs促進創(chuàng)傷修復的作用機制一方面通過自身的增殖、遷移和分化；另一方面通過自分泌或者旁分泌影響損傷部位的多種細胞，如真皮成纖維細胞、炎癥細胞、血管內(nèi)皮細胞等等。而糖尿病皮膚潰瘍愈合是上述多種細胞共同完成的。在多項關于糖尿病皮膚潰瘍的研究中發(fā)現(xiàn)多種生長因子表達不足或者功能障礙是糖尿病皮膚潰瘍不愈合的主要原因。VEGF、HGF和IGF-1是體內(nèi)重要的生長因子，研究表明，hADSCs能分泌大量的 VEGF、HGF和IGF-1，而這些因子在創(chuàng)傷修復過程中起到非常重要的作用[3-5]。本研究中我們通過對AGE-BSA 刺激hADSCs后VEGF、HGF和IGF-1蛋白和mRNA表達的檢測，結果證實AGE-BSA能抑制hADSCs分泌VEGF、HGF和IGF-1。由此推斷，糖尿病患者體內(nèi)高濃度AGEs損傷了hADSCs旁分泌功能，從而影響hADSCs修復創(chuàng)傷的功能。

本研究初步證實AGEs 能夠損傷 hADSCs多種生物學特性。由此推斷臨床上應用hADSCs為糖尿病患者細胞移植和基因治療時，患者體內(nèi)高濃度AGEs能夠損傷hADSCs促進創(chuàng)傷修復功能。深入研究AGEs對hADSCs功能與活性的影響及作用機制, 為臨床上通過抗AGEs生成或基因修飾促進生長因子分泌等干預方法，提高干細胞移植治療的促進創(chuàng)傷修復功能提供新的理論依據(jù)。

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