朱曉彤， 楊 瑞， 周露婷， 張 曄， 李 玲， 章衛(wèi)平， 施廣霞， 陳玉霞△

(1第二軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部病理生理學(xué)教研室, 上海 200433； 2大連醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

鋅指蛋白是一類含有鋅指結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合蛋白，可以正向或者負向地調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄活性，在個體發(fā)育、定向分化、細胞增殖、凋亡和功能調(diào)節(jié)等生命過程中發(fā)揮重要作用。含鋅指和BTB區(qū)蛋白20(zinc finger and BTB domain containing 20, ZBTB20)由741個編碼氨基酸組成，N端含有POZ結(jié)構(gòu)域(通常介導(dǎo)蛋白間的相互作用)，C端含有5個C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域(通常介導(dǎo)DNA 的結(jié)合)，與已知的POZ鋅指蛋白B細胞淋巴瘤6(B-cell lymphoma 6，BCL6)和前髓細胞性白血病鋅指蛋白(promyelocytic leukaemia zinc finger protein, PLZF) 有30%～40%的同源性[1]。利用ZBTB20基因特異性敲除小鼠模型，本實驗室揭示了ZBTB20在個體發(fā)育、物質(zhì)代謝和神經(jīng)調(diào)控等方面有重要的生理功能[2-7]。盡管如此，目前國際上對其生物學(xué)功能的認識仍然非常有限。本研究擬構(gòu)建ZBTB20的重組腺病毒表達載體，并驗證該重組腺病毒在原代肝細胞和小鼠肝臟組織中介導(dǎo)的ZBTB20過表達情況及功能活性，為進一步研究ZBTB20在肝臟的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 材料和試劑

人ZBTB20表達載體pBFN-ZBTB20-FLAG為本實驗室所存，pAdEasy-1/BJ5183菌為本實驗室自行制備；感受態(tài)大腸桿菌DH-5α購自Stratagene；高糖DMEM細胞培養(yǎng)基、胎牛血清、生理鹽水購自HyClone；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 購自Gibco-BRL；限制性內(nèi)切酶購自New England Biolabs；T4連接酶購自TaKaRa；小量質(zhì)粒抽提試劑盒購自O(shè)mega；DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen；雙螢光素酶檢測試劑盒購自Promega；ZBTB20抗體為本實驗室自行制備;FLAG抗體M2購自Sigma;β-tubulin抗體購自Proteintech；HRP標記的羊抗兔與羊抗小鼠II抗購自Cell Signaling。

2 方法

2.1pAd-ZBTB20重組腺病毒載體的構(gòu)建與鑒定BglⅡ/NotⅠ雙酶切含F(xiàn)LAG標簽的人ZBTB20(short isoform)表達質(zhì)粒pBFN-ZBTB20-FLAG，回收ZBTB20-FLAG的 cDNA片段(約2.2 kb)，克隆至穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV[約9.2 kb，攜帶有綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因序列]，得到重組的穿梭載體pAdTrack-ZBTB20。將重組的穿梭載體經(jīng)PmeⅠ酶切線性化后，利用電轉(zhuǎn)化法將其轉(zhuǎn)化到預(yù)轉(zhuǎn)化有pAdEasy-1的感受態(tài)細菌BJ5183中進行同源重組，并在卡那霉素抗性的培養(yǎng)基上進行篩選，挑取單克隆，利用PacⅠ酶切鑒定后，最終得到重組成功的腺病毒載體pAd-ZBTB20；將其轉(zhuǎn)化至DH-5α感受態(tài)細菌中，純化制備質(zhì)粒DNA。

2.2重組腺病毒Ad-ZBTB20的包裝、擴增、純化及滴度測定 包裝和擴增：利用Effectene轉(zhuǎn)染試劑將2 μgPacⅠ酶切線性化的pAd-ZBTB20質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細胞，轉(zhuǎn)染10～14 d后觀察到部分細胞出現(xiàn)細胞病變反應(yīng)(cytopathic effect, CPE)。待細胞完全被病毒感染后，收集細胞，于干冰和37 ℃水浴反復(fù)凍融并劇烈振蕩細胞3次，釋放出腺病毒。將收集到的病毒液重復(fù)感染293細胞3次，最后一次細胞培養(yǎng)規(guī)模為3×108，使腺病毒進一步擴增，從而得到更高滴度的腺病毒Ad-ZBTB20。 純化：將最后收集到的病毒液轉(zhuǎn)移至12 mL離心管中，加入適量的CsCl，調(diào)整密度至(1.32～1.35)×103g/L之間，封以液體石蠟，于10 ℃、176 000×g離心20 h。穿刺收集濃縮的病毒條帶，轉(zhuǎn)移入透析袋(截留分子量為10 kD)，浸入200倍于病毒液體積的透析液中(透析液配方：4%蔗糖，10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，2 mmol/L MgCl2)，4 ℃透析過夜去鹽后分裝保存于-80 ℃。滴度測定：因重組腺病毒載體帶有GFP基因，感染細胞后能同時分別表達GFP和ZBTB20，故而我們采用流式細胞術(shù)檢測病毒滴度：接種細胞于12孔板，密度為4×105。次日加入倍比稀釋后的含重組腺病毒Ad-ZBTB20的培養(yǎng)液，孵育24 h后消化收集細胞，調(diào)整細胞懸液體積為1 mL，計數(shù)板計細胞數(shù)，取200 μL上機檢測GFP陽性的細胞比例，據(jù)如下公式計算病毒滴度[GFU(green fluorescent unit)/mL]=GFP陽性細胞比例×每孔細胞數(shù)/培養(yǎng)液體積(mL)×病毒稀釋度[8]。

2.3重組腺病毒感染的離體細胞模型與在體小鼠模型的建立 離體細胞模型：采用本室建立的兩步原位膠原酶灌注法分離肝臟組織特異性ZBTB20基因敲除小鼠的原代肝細胞[9]，接種于6孔板中進行培養(yǎng)。待肝細胞貼壁后，用PBS清洗2遍，分別加入含有腺病毒Ad-ZBTB20和對照腺病毒Ad-GFP的無血清培養(yǎng)基, 病毒感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)=5～10，孵育12 h后更換以含10% FBS的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)實驗。小鼠在體模型：取肝臟組織特異性ZBTB20基因敲除的同窩小鼠，經(jīng)尾靜脈分別緩慢注射重組腺病毒Ad-ZBTB20和對照病毒Ad-GFP 各5×109(用PBS調(diào)整至總體積200 μL)，常規(guī)飼養(yǎng)3 d后，經(jīng)4%水合氯醛溶液麻醉放血后取肝臟組織，迅速凍存于液氮。

2.4蛋白表達的檢測(Western blotting法) 稱量50 mg液氮凍存的肝臟組織，加入0.5 mL RIPA蛋白裂解液，冰上勻漿后常規(guī)制備蛋白樣品。蛋白樣品經(jīng)Bradford法定量后取20 μg跑8% SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉后先后與小鼠抗ZBTB20單克隆抗體9A10[3](1∶1 000)或小鼠抗FLAG抗體M2(1∶1 000)、兔抗小鼠IgG Ⅱ抗(1∶10 000)雜交，ECL法顯影檢測ZBTB20或FLAG蛋白的含量。再經(jīng)0.2 mol/L NaOH洗膜去除前述抗體后再先后與兔抗小鼠β-tubulin特異性抗體(1∶10 000，作為內(nèi)參照)、山羊抗兔IgG Ⅱ抗(1∶10 000)雜交，ECL法顯影檢測β-tubulin蛋白的含量。

2.5甲胎蛋白-螢光素酶報告基因(alpha fetoprotein-luciferase reporter, AFP-luc)活性的檢測 分離ZBTB20肝臟特異性敲除小鼠的原代肝細胞，以每孔1.5×105的密度接種于24孔板。待細胞貼壁后，加入重組腺病毒Ad-ZBTB20或Ad-GFP(MOI=1～100)孵育過夜。更換新鮮培養(yǎng)液4 h后，用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000試劑轉(zhuǎn)染含AFP啟動子序列的螢光素酶報告基因質(zhì)粒(pAFP-luc)[4]200 ng和內(nèi)參照質(zhì)粒(pRLSV40-Luc)10 ng，轉(zhuǎn)染12 h后更換以新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，裂解細胞，檢測螢光素酶的活性。實驗重復(fù)3次 。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用t檢驗比較各組間螢光素酶活性的差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 重組腺病毒載體pAd-ZBTB20的構(gòu)建和鑒定

BglⅡ/NotⅠ雙酶切鑒定得到的重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-ZBTB20，可見約9.2 kb和2.2 kb片段，提示重組穿梭載體構(gòu)建成功，見圖1A。PmeI線性化的重組穿梭載體pAdTrack-ZBTB20與腺病毒骨架質(zhì)粒 pAdEasy-1在BJ5183細菌中同源重組，將得到的重組腺病毒質(zhì)粒pAd-ZBTB20經(jīng)PacⅠ酶切鑒定，可見約30 kb和3 kb大小的2個片段，提示成功同源重組，見圖1B。

2 重組腺病毒載體Ad-ZBTB20的包裝及滴度測定

用Effectene轉(zhuǎn)染試劑將線性化后的pAd-ZBTB20轉(zhuǎn)染293細胞，轉(zhuǎn)染48 h時可見散在綠色熒光，至第13天，可見明顯的細胞毒效應(yīng)，大多數(shù)細胞變圓漂起(圖2A)，并且所有細胞均有綠色熒光(圖2B)。收集細胞，經(jīng)干冰和37 ℃水浴反復(fù)凍融并劇烈振蕩3次，收集含病毒的細胞裂解液上清，流式細胞術(shù)檢測此病毒滴度為9.1×1010/L。反復(fù)感染3次，收獲病毒總量為6.87×1011。氯化銫超速離心后可見白堊色病毒條帶，穿刺抽吸出病毒條帶并透析去鹽后，用流式細胞術(shù)測得滴度為5.7×1013/L。

Figure 1. Identification of the recombinant vectors by the restrictive endonucleases.A: recombinant shuttle vector digested by Bgl Ⅱ/NotⅠ； 1： pAdTrack-ZBTB20;B: recombinant adenovirus vector digested by PacⅠ; 1：pAd-ZBTB20.

3 重組腺病毒Ad-ZBTB20的表達檢測

感染對照腺病毒的細胞未檢測到ZBTB20蛋白(這與ZBTB20基因特異性敲除的表型相一致)，而感染重組腺病毒Ad-ZBTB20的細胞表達有高豐度的ZBTB20蛋白，其表達水平隨著MOI值的增加而增高。我們以ZBTB20基因所攜帶的FLAG標簽蛋白為檢測對象，也得到了同樣的結(jié)果,見圖3。這提示我們所構(gòu)建的重組腺病毒在離體培養(yǎng)的細胞中能成功表達目標蛋白ZBTB20。重組腺病毒Ad-ZBTB20在小鼠肝臟組織也能成功表達ZBTB20蛋白，見圖4。

Figure 3. Adenovirus-mediated ZBTB20 protein overexpression in the primary hepatocytes from the liver-specific ZBTB20 knockout mice.

Figure 4. Adenovirus-mediated ZBTB20 protein overexpression in the hepatic tissue of liver-specific ZBTB20 knockout mice.

4 重組腺病毒Ad-ZBTB20介導(dǎo)表達的ZBTB20蛋白功能活性的分析

在原代肝細胞模型，重組腺病毒Ad-ZBTB20顯著抑制AFP-luc的活性；當MOI值為1、10和100時，抑制率分別為26.7%、90.9%和79.4%,見圖5。

討 論

新型鋅指蛋白ZBTB20是首先從人樹突狀細胞中克隆并率先報道的含BTB/POZ結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白家族新成員。利用ZBTB20全身和組織特異性敲除小鼠模型，我們實驗室近年來的研究表明ZBTB20參與了機體多種組織器官的發(fā)育、糖脂等物質(zhì)代謝、學(xué)習(xí)記憶能力的調(diào)節(jié)以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程的調(diào)節(jié)[2-7]。

Figure 5. Inhibitory effect of adenovirus-mediated overexpression of ZBTB20 protein on AFP gene transcription in the primary hepatocytes. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs Ad-GFP group at the same MOI.

ZBTB20基因敲除小鼠表現(xiàn)為出生后生長發(fā)育遲緩、生殖能力降低、死亡率升高、低血糖、能量貯備能力降低、多種代謝相關(guān)激素水平異常(如胰高血糖素水平升高，胰島素水平降低，抵抗素水平升高等)；此外，還存在海馬、垂體發(fā)育異常等表型[2-3]。利用海馬成熟的CA1區(qū)特異性ZBTB20敲除小鼠模型，我們發(fā)現(xiàn)ZBTB20缺失導(dǎo)致長期學(xué)習(xí)能力和記憶力降低，N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)受體介導(dǎo)的興奮性突觸后電流減弱，同時存在細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)和cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein, CREB)磷酸化水平降低。這提示ZBTB20參與學(xué)習(xí)記憶能力的形成[5]。此外，利用ZBTB20肝臟特異性基因敲除小鼠模型，本實驗室的研究發(fā)現(xiàn)ZBTB20是胚胎出生后關(guān)閉肝臟AFP轉(zhuǎn)錄表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄抑制因子[4]。另外，ZBTB20還是肝癌預(yù)后的一個獨立預(yù)警因素：與正常肝臟組織和癌旁組織相比，肝癌組織中ZBTB20 mRNA 和蛋白表達水平明顯增加，并且與靜脈侵襲、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的發(fā)生率密切相關(guān)。高表達ZBTB20蛋白的肝癌患者無瘤生存期和總存活期明顯較低表達者為低[10]。而且，ZBTB20近來也被發(fā)現(xiàn)是漢族人患非賁門胃癌的易感基因[11]。這些均提示新型轉(zhuǎn)錄因子ZBTB20在細胞惡變過程中也發(fā)揮著積極的作用。盡管這樣，關(guān)于ZBTB20的生物學(xué)功能、其調(diào)控的下游靶基因以及介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路仍有許多未明之處。

AdEasy腺病毒過表達系統(tǒng)是目前應(yīng)用最為廣泛的病毒表達載體，其原理是通過同源臂重組的方式在細菌中獲得重組腺病毒基因組質(zhì)粒，將克隆了外源基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒(pAdTrack-CMV)與攜帶了腺病毒大部分基因組的質(zhì)粒(pAdEasy) 共轉(zhuǎn)化RecA+細菌，在細菌RecA重組酶的作用下經(jīng)抗性篩選獲得重組腺病毒基因組質(zhì)粒，將其線性化后轉(zhuǎn)染293細胞獲得重組腺病毒。重組腺病毒是非整合型雙鏈DNA病毒，因而無插入突變，無致癌性。它具有轉(zhuǎn)染分裂期和非分裂期細胞的能力，且易于構(gòu)建、濃縮和純化，出毒率較高。重組腺病毒通過腹腔或尾靜脈注射后具有肝臟組織聚集性，因而成為研究肝臟生物學(xué)的重要病毒載體[12]。我們前期的研究提示ZBTB20在肝臟物質(zhì)代謝、肝癌的發(fā)展中具有重要作用，因此具有肝臟靶向性的腺病毒表達載體無疑是我們進一步研究ZBTB20在肝臟的生物學(xué)功能及其作用機制的首選工具。

我們利用AdEasy系統(tǒng)構(gòu)建了ZBTB20的重組腺病毒表達載體，該重組腺病毒感染離體細胞或在體注射后均能成功過表達ZBTB20蛋白。ZBTB20作為一種轉(zhuǎn)錄因子，其功能活性表現(xiàn)在調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。我們前期的研究表明AFP是ZBTB20的靶基因之一，ZBTB20能特異性抑制AFP基因的轉(zhuǎn)錄。利用報告基因技術(shù)，我們進一步證明重組腺病毒介導(dǎo)過表達的ZBTB20蛋白能夠顯著抑制AFP基因的轉(zhuǎn)錄，提示所構(gòu)建的重組腺病毒能夠成功表達有功能活性的ZBTB20蛋白，為深入研究ZBTB20在肝臟的生理病理學(xué)作用及其作用靶點提供了有效的工具。另外，我們還在ZBTB20蛋白C末端連上了FLAG標簽，這為將來通過免疫共沉淀方法富集、純化ZBTB20的共作用蛋白提供了便利。

[參 考 文 獻]

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