于 軍， 陳寶瑩， 趙 鴿， 張學(xué)策， 趙海康

(1西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院中心實驗室，陜西 西安 710038； 2第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教學(xué)實驗中心，陜西 西安 710032；3第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院放射科，陜西 西安 710038； 4西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科，陜西 西安 710061； 5西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710038)

帕金森病(Parkinson disease，PD)是一種常見的進(jìn)行性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，以大腦黑質(zhì)(substantia nigra，SN)多巴胺能(dopaminergic，DA)神經(jīng)元的缺失為主要特征。PD患者的主要癥狀包括：靜止性震顫、僵直、步態(tài)異常等[1-2]。因此，保護(hù)DA神經(jīng)元免受損傷對于防治PD有重要的意義。

1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+)是一種環(huán)境毒素，常被用作復(fù)制帕金森病的細(xì)胞和動物模型[3]。MPP+不僅抑制線粒體復(fù)合物I的活性，還引起微管解聚，導(dǎo)致軸突斷裂并降低神經(jīng)突觸的功能[4-6]，而且MPP+還可以直接抑制DA神經(jīng)元的軸漿轉(zhuǎn)運，從而破壞神經(jīng)的功能，并造成DA神經(jīng)元缺失[7-8]。

鈉尿肽(natriuretic peptides，NPs)是一組結(jié)構(gòu)相似的多肽，包括心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)、腦鈉尿肽(brain natriuretic peptide，BNP)和C型鈉尿肽(C-type natriuretic peptide，CNP)[9]。ANP、BNP和CNP分別含有28、32和22個氨基酸，都有17個氨基酸形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。血管鈉肽(vasonatrin peptide，VNP)是一種人工設(shè)計合成的新型鈉尿肽，在結(jié)構(gòu)上是CNP與ANP的雜合體，由CNP的環(huán)狀結(jié)構(gòu)與ANP的羧基端嵌合而成[10]。NPs通過與鳥苷酸環(huán)化酶(guanylyl cyclase，GC)偶聯(lián)的鈉尿肽受體(natriuretic peptide receptors，NPR)NPR-A或NPR-B結(jié)合，升高細(xì)胞內(nèi)的cGMP水平，而發(fā)揮其作用。NPR-A或NPR-B可以被HS-142-1(一種來自真菌的多糖)選擇性阻斷[11]。ANP和BNP主要與NPR-A結(jié)合，CNP主要與NPR-B結(jié)合。

近年來發(fā)現(xiàn)，NPR在包括嚙齒類的多種動物，以及包括腦的多種組織中廣泛表達(dá)[12-13]。VNP的心血管作用已經(jīng)比較清楚，但是它的神經(jīng)效應(yīng)如何還不清楚。因此，本研究的目的旨在闡明VNP對MPP+所致DA神經(jīng)元損傷的作用，并揭示其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。

材 料 和 方 法

1 試劑

Neurobasal細(xì)胞培養(yǎng)基、B27和胰酶消化液購自Invitrogen。阿糖胞苷(arabinosylcytosine，Ara-C)、多聚賴氨酸(poly-D-lysine)、MPP+、KT-5823和8-溴環(huán)鳥苷酸(8-bromo-cyclic guanylic acid，8-Br-cGMP)均購自Sigma。VNP由江南大學(xué)合成。HS-142-1由魏啟明教授惠贈(John Hopkins University，USA)。[125I]-cGMP放免測定試劑盒購自上海中醫(yī)藥大學(xué)。

2 細(xì)胞培養(yǎng)

C57BL/6小鼠(14日齡)購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，本研究的動物實驗得到西安醫(yī)學(xué)院倫理委員會的許可。胎屬中腦腹側(cè)細(xì)胞的原代培養(yǎng)參照以往的報道進(jìn)行[14-15]。14日齡的孕鼠吸入CO2麻醉、消毒。取出胎鼠，解剖顯微鏡下分離中腦腹側(cè)的組織。生理鹽水沖洗后，剪碎。所有的操作都在冰上進(jìn)行。剪碎的組織于37 ℃、0.125%胰酶中消化15 min后，移入含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM(Invitrogen)培養(yǎng)基離心管。離心，用含2% B27、9 g/L谷氨酰胺、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的Neurobasal培養(yǎng)基重新懸浮，成為單細(xì)胞懸液。接種于放置有預(yù)包被多聚賴氨酸玻片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，接種密度為5×105/L。于37 ℃、含5% CO2孵箱中培養(yǎng)，每2 d更換一半培養(yǎng)液。在第4天，培養(yǎng)液中加入10.0 μmol/L阿糖胞苷。48 h后更換為不含阿糖胞苷的培養(yǎng)液。整個培養(yǎng)過程為7 d。

3 細(xì)胞活力分析

細(xì)胞活力采用MTT比色的方法進(jìn)行分析。細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，接種密度為1×109/L，每孔培養(yǎng)液體積為100 μL。細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的MPP+(0.1、0.5、1.0和10.0 μmol/L)或者特異性的阻斷劑或抑制劑，每組設(shè)定6個平行孔。分別在6、12和24 h檢測細(xì)胞活力。每孔加入10 μL MTT溶液(5 g/L)。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，振蕩10 min，490 nm測定吸光度(absorbance，A)。實驗重復(fù)3次。

4 免疫熒光染色

貼附于蓋玻片上的細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫固定30 min，0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min，用含0.3% Triton X-100的1% BSA封閉非特異性位點(室溫，1 h)。小鼠抗酪氨酸羥化酶單克隆抗體(1∶3 000，Sigma)4 ℃孵育過夜。0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min，之后，Alexa Fluor-594標(biāo)記的驢抗小鼠IgG(1∶400，Molecular Probes of Invitrogen)室溫孵育2 h。0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min，之后，Hoechst 33342 (1∶50)室溫孵育20 min復(fù)染細(xì)胞核。0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min，之后，固定。

熒光顯微鏡觀察，酪氨酸羥化酶陽性細(xì)胞代表多巴胺神經(jīng)元。在每個玻片上隨機選取5個高倍(×40)視野，計算酪氨酸羥化酶陽性細(xì)胞的平均數(shù)。細(xì)胞計數(shù)、軸突的數(shù)目和長度分析均用Image-Pro Plus 6.0軟件。

5 細(xì)胞內(nèi)cGMP水平測定

細(xì)胞接種于90 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿(每個培養(yǎng)皿1×106細(xì)胞)用于放免分析。細(xì)胞經(jīng)過同步化之后，將細(xì)胞孵育于含不同濃度VNP的無血清培養(yǎng)基。HS-142-1組在加入VNP之前，用100 μg/L HS-142-1預(yù)處理15 min。迅速棄培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)皿加入1 mL冰冷的三氯乙酸(0.24 mmol/L)，從培養(yǎng)皿刮取細(xì)胞。離心，去除沉淀析出的蛋白。1 mL無水乙醇清洗上清液3次。采用[125I]-cGMP放免測定試劑盒測定上清液中的cGMP水平，cGMP放免測定的敏感度為每管50 fmol。

6 Western blotting檢測β-微管蛋白III(β-tubulin III)的解聚

細(xì)胞用1 μmol/L MPP+處理24 h后，用洗脫液(2.0 g多聚甲醛、2.0 g NaOH、0.71 g Na2HPO4·12H2O、0.6 g NaH2PO4·2H2O、1.9 g EGTA、0.2 g MgCl2、0.1 mL Triton X-100溶于蒸餾水，定容50 mL，pH 7.0)洗脫，以去除解聚的β-tubulin III。含150 mmol/L NaCl的RIPA buffer裂解細(xì)胞，20 000×g離心10 min，獲取上清，行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Immobilon P)。進(jìn)行染色，I抗分別為抗小鼠β-tubulin III抗體(1 mg/L)和抗小鼠β-actin(40 μg/L, Santa Cruz)。II抗采用辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記，化學(xué)發(fā)光法檢測(ECL Plus; Amersham Pharmacia)。

7 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。采用SPSS 15.0分析?？傮w差異采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 VNP明顯減輕MPP+導(dǎo)致的DA神經(jīng)元退行性病變

與對照組相比，MPP+明顯降低細(xì)胞活力(圖1)，并造成DA神經(jīng)元減少(圖2)。MPP+(10 μmol/L)作用24 h可以使細(xì)胞活力降低52%，并且神經(jīng)軸突的數(shù)目(圖3A)和長度(圖3B)也都顯著減少。而VNP能夠劑量依賴地抑制MPP+導(dǎo)致的DA神經(jīng)元異常。VNP(10-7mol/L，本研究中用到的最高濃度)顯著增強暴露于MPP+的細(xì)胞活力(圖2A)，并使DA神經(jīng)元的數(shù)量(圖2B)增加近50%，軸突數(shù)目(圖3A)增加70%，軸突長度(圖3B)增加30%。Western blotting分析發(fā)現(xiàn)，MPP+造成的β-tubulin Ⅲ解聚，可以被VNP部分逆轉(zhuǎn)(圖4)。

Figure 1. Effects of MPP+ on the viability of cultured neurons from mice.Mean±SD.n=4.*P<0.05, **P<0.01 vs control.

Figure 2. Effects of VNP on the cultured neurons exposed to MPP+. A: the cell viability was determined by the means of MTT assay; B: the tyrosine hydroxylase-immunoreactive (TH-ir) neurons were photographed and counted under fluorescence microscopy (×400). Mean±SD. n=6.**P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs MPP+.

Figure 3. Effects of VNP on the number (A) and length (B) of cultured tyrosine hydroxylase-immunoreactive neurons exposed to MPP+. Mean±SD. n=8.**P<0.01 vs control; #P<0.05, ##P<0.01 vs MPP+ group.

Figure 4. Effects of VNP on the expression of polymerized β-tubulin Ⅲ in cultured neurons exposed to MPP+.Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs control and VNP+MPP+ group.

2 VNP激活cGMP/PKG信號通路

如圖5A所示，10-9～10-7mol/L VNP呈劑量依賴性地升高細(xì)胞內(nèi)的cGMP水平，由(24±12)nmol/L升高至(183±44)nmol/L。HS-142-1 (100 μg/L)阻斷VNP(10-7mol/L)升高胞內(nèi)cGMP的效應(yīng)。

由于VNP造成胞內(nèi)cGMP的堆積，我們接下來應(yīng)用8-Br-cGMP(膜通透性的cGMP類似物)模擬VNP的效應(yīng)。正如所料，8-Br-cGMP與VNP類似，也增加神經(jīng)元的活力(圖5B)。進(jìn)而，將HS-142-1和KT-5823(cGMP依賴性蛋白激酶的抑制劑)分別應(yīng)用于PKG信號通路的關(guān)鍵點，發(fā)現(xiàn)VNP減弱MPP+神經(jīng)毒性的效應(yīng)可以被100 μg/L的HS-142-1或10-6mol/L KT-5823完全阻斷(圖5B)。

Figure 5. Effects of VNP on the cultured neurons were mimicked by 8-Br-cGMP, whereas blocked by HS-142-1 or KT5823. Mean±SD.n=4.**P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs MPP+; △△P<0.01 vs VNP+MPP+.

討 論

本研究首次發(fā)現(xiàn)，已知的心血管肽VNP具有神經(jīng)保護(hù)作用。我們的研究表明VNP減輕MPP+所致的神經(jīng)損傷。類似的，我們以往在心血管系統(tǒng)的研究中發(fā)現(xiàn)，VNP減輕低氧導(dǎo)致的心血管系統(tǒng)損害[16-17]和肝纖維化[18]。這些結(jié)果表明，VNP對于血管、心臟和神經(jīng)等多種組織具有廣泛的保護(hù)作用。

與血管平滑肌類似，神經(jīng)系統(tǒng)中也存在cGMP信號通路。一些升高細(xì)胞內(nèi)cGMP的物質(zhì)，如NO、8-Br-cGMP具有抗神經(jīng)元凋亡的作用[19]。在神經(jīng)退行性病變中，存在環(huán)核苷酸磷酸二酯酶(cyclic nucleotide phosphodiesterases，PDEs)導(dǎo)致的cGMP降解，以及PKG信號通路的異常[20]。本研究中VNP對于DA神經(jīng)元的保護(hù)效應(yīng)，也可能與其抗凋亡作用有關(guān)。

NPR-A(B)/cGMP/PKG途徑是VNP調(diào)控心血管系統(tǒng)的經(jīng)典信號通路[16，21-22]。本研究也證明VNP的神經(jīng)效應(yīng)也依賴NPR-A(B)/cGMP/PKG途徑：首先，VNP增強細(xì)胞活力的效應(yīng)可以被8-Br-cGMP所模擬，被KT-5823所阻斷。其次，HS-142-1可完全阻斷VNP的效應(yīng)，提示VNP的神經(jīng)效應(yīng)是經(jīng)鳥甘酸環(huán)化酶(guanylate cyclase，GC)偶聯(lián)的NPR介導(dǎo)的。但是，由于HS-142-1既能阻斷NPR-A也能阻斷NPR-B，所以從現(xiàn)有的數(shù)據(jù)我們尚不能確定是哪種GC偶聯(lián)的NPR(NRP-A或NPR-B)發(fā)揮作用，這是本研究的局限性之一。以往，Müller等[13]報道，在未成年腦組織，以NPR-B為主，在成年的腦組織NPR-A占優(yōu)勢。從這個角度來說，在胎鼠神經(jīng)元，VNP很可能是通過NPR-B發(fā)揮作用的。但這還需要直接的實驗證據(jù)。

作為一種人工設(shè)計合成的鈉尿肽，VNP不但擁有天然鈉尿肽如ANP、CNP的特性，而且還具有其親本分子不具有的特性。馮華松等[23]證明，VNP比ANP和CNP有更強大的擴(kuò)張大鼠肺動脈和腹主動脈的效應(yīng)。而且，VNP抑制肺動脈血管平滑肌增殖的效應(yīng)也顯著強于ANP或CNP[16]。有理由推測，VNP的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)也可能強于天然的鈉尿肽。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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