陳依雨， 呂俊華， 張 梅

(1廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，廣州 廣東 510082； 2暨南大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室,廣州 廣東510630)

糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids, GCs)是腎上腺皮質(zhì)分泌的具有廣泛生理效應(yīng)的固醇類(lèi)激素。以往認(rèn)為生理水平的GCs主要參與調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝，超生理劑量的GCs才具有抗炎、抑制免疫反應(yīng)等多種藥理作用。但近年研究發(fā)現(xiàn)生理水平的GCs 同樣具有抗炎作用，其抗炎作用是通過(guò)GCs-糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptors, GRs)途徑增強(qiáng)核組蛋白脫乙酰酶的活性，從而抑制核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)和激活蛋白1 (activator protein-1，AP-1) 的轉(zhuǎn)錄來(lái)實(shí)現(xiàn)，這一發(fā)現(xiàn)擴(kuò)充了體液抗炎機(jī)制的內(nèi)涵[1-3]。2002年Tracey等[4]發(fā)現(xiàn)了一種新的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制——膽堿能神經(jīng)抗炎通路(cholinergic anti-inflammatory pathway, CAP)，介導(dǎo)這一通路的是迷走神經(jīng)，其通過(guò)遞質(zhì)乙酰膽堿作用于免疫細(xì)胞，抑制炎癥因子釋放起到抗炎作用。隨后研究發(fā)現(xiàn)α7煙堿型乙酰膽堿受體(α7 nicotinic acetylcholine receptor, α7nAChR)處于膽堿能抗炎通路的核心，是調(diào)控炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵分子[5]。作為機(jī)體內(nèi)2個(gè)重要的內(nèi)源性抗炎系統(tǒng)，生理濃度GCs與膽堿能神經(jīng)抗炎通路在面對(duì)炎癥挑戰(zhàn)時(shí)是否存在交叉對(duì)話(huà)(crosstalk)，兩者之間關(guān)系如何，本研究擬對(duì)此進(jìn)行探討。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco-BRL；新生牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程有限公司；胰蛋白酶、HEPES、DMSO、MTT、氫化可的松、甲基牛扁亭堿(methyllycaconitine，MLA)和脂多糖(lipopolysaccharides，LPS) 均購(gòu)自Sigma。Mouse IL-1 beta ELISA Ready-SET-Go!試劑盒和Mouse TNF-alpha ELISA Ready-SET-Go!試劑盒為eBioscience產(chǎn)品。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2由中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞中心提供。于37 ℃、5% CO2的條件下，用含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2藥物處理和實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)各組。LPS的最適作用濃度和時(shí)間由其誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥因子的量效曲線(xiàn)和量時(shí)曲線(xiàn)獲得，實(shí)驗(yàn)中使用0.1 mg/L LPS刺激BV-2細(xì)胞6 h用于誘導(dǎo)TNF-α的產(chǎn)生，使用1 mg/L LPS刺激BV-2細(xì)胞24 h用于誘導(dǎo)IL-1β的產(chǎn)生。根據(jù)BV-2細(xì)胞活性測(cè)定和GCs抗炎實(shí)驗(yàn)，選用300 nmol/L氫化可的松作為生理濃度(正常機(jī)體內(nèi)皮質(zhì)醇生理濃度為110～520 nmol/L[6])用于實(shí)驗(yàn)，LPS刺激之前預(yù)先給予氫化可的松孵育30 min，α7nAChR阻斷劑MLA(10 nmol/L)則在氫化可的松處理前30 min加入培養(yǎng)液。

2.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以5×107/L密度接種于96孔板，100 μL/well，每組設(shè)6個(gè)平行孔。BV-2細(xì)胞在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜，給予氫化可的松處理24 h，每孔加5 g/L MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出培養(yǎng)液，加DMSO 150 μL/well，待甲臜完全溶解后，用酶聯(lián)免疫儀在波長(zhǎng)570 nm處讀取吸光度(A)。細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)孔A均值/對(duì)照組A均值×100%。

2.4ELISA法測(cè)定細(xì)胞上清細(xì)胞因子濃度 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以5×108/L密度接種于24孔板，500 μL/well，每組設(shè)3個(gè)平行孔。在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜，加入LPS刺激適宜時(shí)間，收集細(xì)胞上清。測(cè)定方法按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作參照說(shuō)明書(shū)，設(shè)定8個(gè)濃度梯度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 14.0分析，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，組間比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗(yàn)，用最小顯著差異(least significant difference, LSD)法進(jìn)行均數(shù)間的多重比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同濃度GCs對(duì)BV-2細(xì)胞活性的影響

給予2 000、1 000、500、250、125、62.5和30 nmol/L氫化可的松分別作用于BV-2細(xì)胞24 h，結(jié)果表明2 000 nmol/L和1 000 nmol/L氫化可的松可使細(xì)胞存活率降低至(76.9±5.5)%和(90.8±7.3)%，而250 nmol/L(生理濃度范圍)氫化可的松對(duì)細(xì)胞存活率影響很小[(96.4±6.8)%],見(jiàn)圖1。

Figure 1. Effects of different concentrations of GCs on the viabi-lity of BV-2 cells.Mean±SEM.n=6.*P<0.05 vs control.

2 LPS刺激BV-2細(xì)胞釋放炎癥因子的時(shí)量變化

分別給予0.02、0.1、0.5、1、10 (或0.1、0.5、1、5、10)mg/L LPS刺激BV-2細(xì)胞3 h、6 h、12 h和24 h，細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-1β的含量隨著LPS刺激濃度增加和刺激時(shí)間延長(zhǎng)逐漸遞增，呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴(lài)性的關(guān)系，見(jiàn)圖2。

3 生理濃度GCs對(duì)LPS誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞釋放炎癥因子的影響

ELISA結(jié)果顯示，500和250 nmol/L氫化可的松預(yù)處理BV-2細(xì)胞，均可減少LPS誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞釋放TNF-α和IL-1β，提示生理濃度范圍的GCs可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)炎癥，也進(jìn)一步證實(shí)了生理濃度GCs的抗炎作用,見(jiàn)圖3。

Figure 2. The releases of TNF-α (A) and IL-1β (B) in BV-2 cells stimulated by LPS.Means±SEM.n=3.

Figure 3. The effects of physiological concentrations of GCs on releases of TNF-α (A) and IL-1β(B) in BV-2 cells stimulated by LPS.Mean±SEM.n=3.**P<0.01 vs control; #P<0.05 vs LPS.

4 MLA對(duì)生理濃度GCs抗炎作用的影響

ELISA結(jié)果顯示，α7nAChR阻斷劑MLA(10 nmol/L)預(yù)處理BV-2細(xì)胞，明顯拮抗300 nmol/L氫化可的松對(duì)LPS誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞釋放TNF-α和IL-1β的抑制作用,見(jiàn)圖4，提示α7nAChR參與并介導(dǎo)了生理濃度GCs的抗炎作用。此外，顯微鏡下觀(guān)察可見(jiàn)LPS刺激可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2活化，表現(xiàn)為細(xì)胞偽足和突起明顯增多；300 nmol/L 氫化可的松可使LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞偽足和突起明顯減少，顯著抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化；而MLA則拮抗氫化可的松這一作用，使BV-2細(xì)胞活化增加，見(jiàn)圖5。

Figure 4. The effects of MLA on releases of TNF-α (A) and IL-1β (B) in BV-2 cells with GCs treatment and LPS stimulation.Means ±SEM.n=3. **P<0.01 vs control;△P<0.05 vs LPS; #P<0.05 vs GCs+LPS.

討 論

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的巨噬細(xì)胞，生理情況下負(fù)責(zé)清除病原體和異物以維持腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)，但持續(xù)激活后產(chǎn)生大量的炎癥因子，引起神經(jīng)元損傷。大量證據(jù)表明小膠質(zhì)細(xì)胞激活引起的腦內(nèi)炎癥參與了神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)生和發(fā)展，故抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化和控制腦內(nèi)炎癥反應(yīng)已成為治療這一類(lèi)疾病的重要策略[7]。α7nAChR作為膽堿能神經(jīng)抗炎通路的關(guān)鍵分子，在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中的作用逐漸受到關(guān)注。Shytle等[8]首次報(bào)道培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞上大量表達(dá)α7nAChR，并且與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，尼古丁或乙酰膽堿(α7nAChR激動(dòng)劑)明顯降低LPS 刺激引起的TNF-α等炎癥因子產(chǎn)生。近年研究發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞上亦有含量豐富的GRs，這使其成為GCs的直接抗炎靶標(biāo)[9]。因此，同時(shí)表達(dá)GRs和α7nAChR的小膠質(zhì)細(xì)胞是連接GCs和膽堿能神經(jīng)抗炎通路的重要樞紐，直接參與腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的調(diào)控。

Figure 5. The effects of MLA on the morphology of BV-2 cells (×20).A: untreated cells (control); B: the cells treated with 0.1 mg/L LPS for 12 h (LPS group); C: the cells were treated with 300 nmol/L hydrocortisone 30 min before LPS (GCs+LPS group); D: pretreatment with 10 nmol/L MLA 30 min before hydrocortisone and LPS (MLA+GCs+LPS group).

傳統(tǒng)觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為只有藥理(超生理)劑量的GCs才具有抗炎作用，但我們實(shí)驗(yàn)室在心血管系統(tǒng)的研究表明，生理濃度GCs同樣發(fā)揮抗炎效應(yīng)[1-3]。雖然嚙齒類(lèi)動(dòng)物分泌的GCs以皮質(zhì)酮為主，但本研究是體外實(shí)驗(yàn)，故仍然使用皮質(zhì)醇作為實(shí)驗(yàn)藥物，研究結(jié)果顯示高濃度GCs可以降低BV-2細(xì)胞存活率，表明超生理劑量GCs具有損傷小膠質(zhì)細(xì)胞的作用，這一結(jié)果與高濃度皮質(zhì)醇可致海馬神經(jīng)元損傷的報(bào)道一致，也間接解釋了應(yīng)激可造成機(jī)體功能紊亂。實(shí)驗(yàn)中使用LPS刺激小膠質(zhì)細(xì)胞，觀(guān)察GCs對(duì)炎癥因子TNF-α和IL-1β生成的影響，結(jié)果顯示生理濃度范圍內(nèi)(250～500 nmol/L)的GCs也明顯抑制炎癥因子產(chǎn)生，這不僅表明生理濃度GCs可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，也進(jìn)一步驗(yàn)證生理濃度GCs的抗炎效應(yīng)。但在面對(duì)炎癥挑戰(zhàn)時(shí)，生理濃度GCs抗炎作用的發(fā)揮是否與α7nAChR有關(guān)，尚不得而知。本研究發(fā)現(xiàn)，α7nAChR的特異性阻斷劑MLA預(yù)處理小膠質(zhì)細(xì)胞可使生理濃度GCs抑制炎癥因子生成的作用減弱，表明MLA拮抗了生理濃度GCs的抗炎作用。

老化是神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病發(fā)生的高危因素。在老化過(guò)程中持續(xù)慢性應(yīng)激導(dǎo)致下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal, HPA)軸的功能亢進(jìn)，引起體內(nèi)GCs分泌紊亂。研究表明隨著年齡增長(zhǎng)，動(dòng)物和人體內(nèi)GCs水平不斷升高。急性和慢性應(yīng)激都會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的敏化，在某些情況下升高的GCs甚至展現(xiàn)出促炎效應(yīng)[10]。因此，生理濃度GCs的抗炎作用可能在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)生中扮演更為重要的角色。作為機(jī)體固有的2個(gè)內(nèi)源性抗炎系統(tǒng)，在神經(jīng)系統(tǒng)炎癥中體液抗炎和膽堿能神經(jīng)抗炎機(jī)制之間存在何種聯(lián)系是本研究的目的。我們實(shí)驗(yàn)中使用的小膠質(zhì)細(xì)胞不僅是介導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是GCs和膽堿能通路的共同抗炎靶標(biāo)，研究結(jié)果顯示α7nAChR阻斷劑可以拮抗生理濃度GCs抑制炎癥反應(yīng)的作用，提示α7nAChR參與了生理濃度GCs的抗炎作用。但2條通路之間如何協(xié)同發(fā)揮抗炎作用，GCs是否通過(guò)調(diào)節(jié)α7nAChR表達(dá)，抑或膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)通過(guò)影響GCs-GRs通路參與神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，尚需在進(jìn)一步的研究工作中深入探討。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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