王達安， 林逸心， 王 崢， 桑朝磊， 陸大祥， 王華東， 胡巢鳳， 魏 偉， 蔣建偉， 付詠梅， 李紅梅

(暨南大學醫(yī)學院 1病理生理學系， 2國家中醫(yī)藥管理局病理生理學重點實驗室，3口腔系2010級學生， 4生物化學系，廣東 廣州 510632)

沙利度胺(thalidomide, THD)目前主要用于麻風病、多發(fā)性骨髓瘤等疾病的治療[1]。最新研究資料顯示，沙利度胺也具有良好的抗肺纖維化(pulmonary fibrosis, PF)作用，但確切的藥理機制尚未闡明[2-4]。轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)誘導肺成纖維細胞等多種細胞的結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)表達增多被認為是肺纖維化發(fā)病的重要環(huán)節(jié)[5]。本研究利用螢光素酶報告基因系統(tǒng)，觀察沙利度胺對TGF-β1誘導的人胚肺成纖維細胞(human embryonic lung fibroblast, HELF)CTGF基因啟動子激活作用的影響，為闡明沙利度胺抗肺纖維化的藥理機制提供進一步的依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

人胚肺成纖維細胞系(南京凱基)；DMEM細胞培養(yǎng)液(Gibco)；小牛血清(浙江天杭)；DM2000 DNA ladder、Taq MasterMix試劑盒和感受態(tài)大腸桿菌DH5α(廣州美津)；限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BglⅡ(Toyobo)；T4 DNA連接酶(NEB)；pGL3-Basic質(zhì)粒、pRL-SV40質(zhì)粒和螢光素酶檢測試劑盒Dual-Lucife-rase Reporter Assay System(Promega)；PCR產(chǎn)物抽提試劑盒和去內(nèi)素質(zhì)粒小提試劑盒(Biomiga)，GeneFinderTM核酸染料(夏門致善)；瓊脂糖(無錫NEST)；脂質(zhì)體Polyplus-transfection試劑盒(Bioparc-Bd S. Brant)；人類重組TGF-β1(PeproTech)；THD(Sigma)。

2 方法

2.1構(gòu)建熒光素酶報告基因重組質(zhì)粒pGL3-CTGFP 根據(jù)人類CTGF基因啟動子序列(GenBank登錄號AF316368)設計合成引物(由上海捷瑞合成)，上游引物5’-GCCAGATCTTCCCTTTTTCTGGAAACATTGATGG-3’(BglⅡ)，下游引物5’-CTGAAGCTTCTGACAGGGCGAGGAGGAGGAC-3’(HindⅢ)，以正常人外周血白細胞cDNA為模板，通過PCR擴增獲取人CTGF基因啟動子片段，PCR產(chǎn)物長度為1026 bp，反應條件：94 ℃預變性2 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，共35個循環(huán)。用限制性內(nèi)切酶BglⅡ和HindⅢ雙酶切載體pGL3-Basic，用T4連接酶將PCR目的片段連接到酶切載體上，構(gòu)成pGL3-CTGFP重組質(zhì)粒，所構(gòu)建重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、雙酶切和測序(華大基因)鑒定。

2.2TGF-β1對CTGF基因啟動子活性影響的分析 按每孔1×105個細胞將HELF細胞接種于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置5% CO2、37 ℃中培養(yǎng)，待細胞生長至融合度約70%時，更換不含小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，用脂質(zhì)體Polyplus-transfection(1 μL)將重組質(zhì)粒pGL3-CTGFP(0.5 μg)轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)的HELF細胞中，同時轉(zhuǎn)染含有海腎螢光素酶的pRL-SV40質(zhì)粒(0.5 μg)作為內(nèi)參照，培養(yǎng)24 h后，按加入的TGF-β1濃度分組(TGF-β1終濃度分別為0、2.5、5、10和20 μg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收獲細胞檢測螢光素酶報告基因活性變化，其中，0 μg/L TGF-β1為對照組(control group)，其余為實驗組；另外，以同條件培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染等量空載體pGL3-Basic和pRL-SV40質(zhì)粒的HELF細胞(不加TGF-β1)為空白對照組(blank group)，以觀察TGF-β1對CTGF基因啟動子作用的量效關(guān)系；為觀察TGF-β1對CTGF基因啟動子作用的時效關(guān)系，按同樣方法進行細胞培養(yǎng)、重組質(zhì)粒pGL3-CTGFP和內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-SV40轉(zhuǎn)染后24 h，加入5 μg/L TGF-β1，按分組分別培養(yǎng)0 h、12 h、24 h、48 h和72 h后收獲細胞，其中，加入TGF-β1后培養(yǎng)0 h的為對照組(control group)，其余為實驗組；另外，以同條件培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染等量空載體pGL3-Basic和pRL-SV40質(zhì)粒的HELF細胞(不加TGF-β1)為空白對照組(blank group)；各組細胞培養(yǎng)至預定時間后收獲細胞，按Dual-Luciferase Reporter Assay System試劑盒操作手冊，使用MD-SpectraMax M5多光譜微孔板閱讀器在560 nm和465 nm波長處檢測2種螢光素酶的發(fā)光值，以螢火蟲螢光素酶發(fā)光值/海腎螢光素酶發(fā)光值的比值為相對螢光素酶活性，以反映CTGF基因啟動子的活性；每次每組3復孔，實驗重復3次。

2.3THD對TGF-β1誘導的CTGF基因啟動子活性上調(diào)的干預作用分析 按2.2的同樣方法進行HELF細胞培養(yǎng)、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染；pGL3-CTGFP質(zhì)粒和pRL-SV40質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h后，加入5 μg/L TGF-β1，并同時按分組分別加入不同濃度THD (THD終濃度分別為0、25、50和100 μg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h收獲細胞，其中，0 μg/L THD為對照組(control group)，其余為實驗組；另外，以同條件培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染等量重組質(zhì)粒pGL3-CTGFP和pRL-SV40質(zhì)粒的HELF細胞(不加TGF-β1和THD)為無剌激組(non-treatment group)，另一組按前述方法轉(zhuǎn)染pGL3-CTGFP質(zhì)粒后不加TGF-β1，而只加入50 μg/L的THD為單純藥物組(THD組)；培養(yǎng)結(jié)束后，按方法2.2所述測定各組相對螢光素酶活性；每次每組3復孔，實驗重復3次。

3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 11.0統(tǒng)計學軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，各組間均數(shù)比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 重組質(zhì)粒鑒定

重組質(zhì)粒pGL3-CTGFP以前述引物作PCR擴增、用限制性內(nèi)切酶BglⅡ和HindⅢ作雙酶切處理，產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳后，PCR產(chǎn)物和雙酶切產(chǎn)物均在1 000 bp(1 026 bp)左右位置顯示清晰條帶，與預期的插入片段大小相符，見圖1。應用GL2和RV3通用測序引物對pGL3-CTGFP質(zhì)粒進行雙向測序鑒定，測序結(jié)果與GenBank上提供的序列完全相同，提示含有人類CTGF基因啟動子的螢光素酶報告基因重組質(zhì)粒pGL3-CTGFP構(gòu)建成功。

Figure 1. Identification of recombinant plasmid pGL3-CTGFP．Lane 1: PCR product; Lane 2: DNA marker; Lane 3: plasmid pGL3-CTGFP digested by restriction endonuclease.

2 TGF-β1對HELF細胞中CTGF基因啟動子活性的影響

從圖2、3可見，不加TGF-β1而單純轉(zhuǎn)染pGL3-CTGFP質(zhì)粒的對照組的相對螢光素酶活性顯著高于僅轉(zhuǎn)染pGL3-Basic空載體的空白對照組(P<0.05)，說明靜息狀態(tài)下HELF細胞中CTGF也有一定的基礎(chǔ)表達；而轉(zhuǎn)染pGL3-CTGFP質(zhì)粒并給予不同TGF-β1剌激24 h的各實驗組的相對螢光素酶活性均高于對照組(P<0.05)，其中以5 μg/L TGF-β1實驗組的相對螢光素酶活性最高，其相對螢光素酶活性為對照組的2.16倍，見圖2；在觀察TGF-β1對CTGF基因啟動子作用時效關(guān)系的實驗中，轉(zhuǎn)染pGL3-CTGFP質(zhì)粒后加入TGF-β1培養(yǎng)0 h的對照組的相對螢光素酶活性也顯著高于空白對照組(P<0.05)，而添加TGF-β1后培養(yǎng)不同時間的各實驗組相對螢光素酶活性均高于對照組(P<0.05)，其中以剌激12 h實驗組的相對螢光素酶活性最高，其相對螢光素酶活性為對照組的2.52倍，見圖3。以上實驗結(jié)果表明，TGF-β1能以劑量依賴和時間依賴方式顯著上調(diào)HELF細胞中CTGF基因啟動子的活性。

Figure 2. Dose-effect relationship of CTGF gene promoter activation by TGF-β1 in HELF cell line. #P<0.05 vs blank group (with pGL3-Basic alone);*P<0.05 vs control group (with pGL3-CTGFP alone).

Figure 3. Time-effect relationship of aviation of CTGF gene promoter by TGF-β1 in HELF cell line.#P<0.05 vs blank group (with pGL3-Basic alone); *P<0.05 vs control group(with pGL3-CTGFP alone).

3 THD對TGF-β1誘導的HELF細胞中CTGF基因啟動子活性上調(diào)的影響

從圖4可見，轉(zhuǎn)染pGL3-CTGFP質(zhì)粒并添加TGF-β1的對照組的相對螢光素酶活性顯著高于單純轉(zhuǎn)染pGL3-CTGFP質(zhì)粒而不加TGF-β1的無剌激組(P<0.05)；但pGL3-CTGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后同時加入TGF-β1和不同濃度THD的實驗組，其相對螢光素酶活性又均低于對照組(P<0.05)，其中以添加50 μg/L THD實驗組的相對螢光素酶活性最低，其相對螢光素酶活性僅為對照組的0.61倍。轉(zhuǎn)染pGL3-CTGFP后50 μg/L THD的單純藥物組的相對螢光素酶活性與無剌激組無顯著差別(P>0.05)。此實驗結(jié)果表明，THD能以劑量依賴方式抑制TGF-β1誘導的CTGF基因啟動子的激活，而THD對CTGF基因啟動子基礎(chǔ)活性無明顯影響。

Figure 4. Effects of thalidomide (THD) on TGF-β1-induced activation of CTGF gene promoter in HELF cell line. #P<0.05 vs non-treatment group (with pGL3-CTGFP alone);*P<0.05 vs control group (with pGL3-CTGFP and TGF-β1， without THD).

討 論

CTGF是一種富含半胱氨酸、分子量為36～38 kD的分泌性多肽，屬于高度保守的即刻早期基因CCN家族成員，1991年由Bradham等[6]首次在人臍靜脈內(nèi)皮細胞中發(fā)現(xiàn)，其廣泛存在于人類心臟、肺臟、肝臟、腎臟和結(jié)締組織等多種組織器官中；CTGF具有促有絲分裂、刺激細胞遷移、介導細胞黏附、促進細胞表型轉(zhuǎn)化、促進成纖維細胞增殖和細胞外基質(zhì)合成，以及促進血管形成等生物學作用；病理情況下，過度表達的CTGF與肺纖維化、肝硬化、糖尿病腎病等器官纖維化發(fā)病有密切關(guān)系[7]。Lasky等[5]發(fā)現(xiàn)，分別給予博萊霉素敏感的C57BL/6小鼠和博萊霉素抵抗的BALB/c小鼠同等劑量的博萊霉素氣管內(nèi)注入后，只有C57BL/6博萊霉素敏感小鼠發(fā)生肺纖維化及CTGF mRNA表達的上調(diào)，而BALB/c博萊霉素抵抗小鼠CTGF mRNA的表達無明顯改變。研究發(fā)現(xiàn)，在特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary interstitial fibrosis，IPF)患者的肺泡灌洗液和纖維化肺組織中CTGF mRNA和蛋白表達明顯上調(diào)，纖維化組織中的CTGF主要定位于增生的Ⅱ型肺泡上皮細胞和活化的成纖維細胞中[8-10]。齊曼古力·吾守爾等[11]報道，原位雜交和免疫組化顯示IPF患者肺組織的CTGF 的mRNA和蛋白質(zhì)表達上調(diào)，并與反映纖維化程度的纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)表達水平呈正相關(guān)關(guān)系，ELISA檢測結(jié)果表明肺纖維化程度較嚴重的IPF患者血清中CTGF水平也是升高的。CTGF在器官纖維化發(fā)病中的主要作用包括剌激成纖維細胞轉(zhuǎn)分化、增殖和分泌膠原[7]；CTGF參與肺成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化過程，而肌成纖維細胞是肺纖維化時肺間質(zhì)中膠原纖維的主要來源。劉小菁等[12]報道，CTGF-siRNA能抑制肺成纖維細胞的增殖、表型轉(zhuǎn)化及細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成。

TGF-β1是器官纖維化過程中最重要的致纖維化因子之一，在肝、肺、腎等臟器纖維化模型中均有過度表達；眾多研究表明，CTGF很可能是介導TGF-β1促纖維化作用的一個重要的下游因子[13]。體外細胞培養(yǎng)實驗表明，肺成纖維細胞不但可以表達CTGF，而且當培養(yǎng)液中加入TGF -β1后能夠誘導CTGF表達明顯增加[5]。Grotendorst等[14]發(fā)現(xiàn)在CTGF啟動子-157到-145位有一個TGF-β反應元件(TGF-β response element, TβRE)，該區(qū)域點突變可致TGF-β1對CTGF的誘導作用完全消除；應用反義CTGF技術(shù)可以阻斷TGF-β1引起的促纖維化效應[15]。雖然TGF-β1和CTGF在器官纖維化發(fā)生機制中屬同一信號轉(zhuǎn)導通路中的信號分子，但TGF-β1具有雙面作用，正常表達時發(fā)揮抑制炎癥和細胞過度增殖的正面效應，過度表達時才會引起ECM積聚和組織器官纖維化等負面效應；例如，研究發(fā)現(xiàn)，敲除TGF-β1基因的小鼠因為失去對炎癥的抑制作用而在出生后很快死于全身性炎癥[16]，因此限制了拮抗TGF-β1作為靶標的治療策略的應用。CTGF作為TGF-β1的下游效應介質(zhì)，只介導TGF-β1的負面效應，TGF-β1的正面效應則由非CTGF途徑所介導；在正常情況下CTGF表達水平很低，而且主要在間質(zhì)細胞表達，其作用也限于結(jié)締組織，拮抗CTGF不會出現(xiàn)阻斷TGF-β1后可能產(chǎn)生的有害臨床反應。因此，相比TGF-β1來說，通過阻斷CTGF達到的抗纖維化作用應該更加特異和安全。

沙利度胺又名反應停，化學名為α-肽胺哌啶酮；沙利度胺在20世紀50年代曾作為鎮(zhèn)靜劑用于治療妊娠嘔吐, 但其后不久因被發(fā)現(xiàn)可引起嬰兒的肢畸形及無肢畸形(海豹綜合征)，使該藥迅速撤出市場。20世紀90年代后，由于發(fā)現(xiàn)沙利度胺具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)、抗血管生成、抗腫瘤等作用，沙利度胺又被重新以新的適應癥開發(fā)使用。美國FDA于1998年批準了沙利度胺作為麻風病的治療用藥，2006年又增加其治療多發(fā)性骨髓瘤的適應證[1]。近年臨床及動物實驗研究表明，沙利度胺對肝、腎、肺等器官纖維化均有一定的治療作用。臨床研究顯示，沙利度胺可提高肺間質(zhì)纖維化老年患者的臨床治療總有效率、胸部CT病變吸收率和肺功能指標[2]。Ye等[17]證實沙利度胺能減少IPF患者肺泡灌洗液中IL-18、IL-8和TNF-α的釋放。Tabata等[3]和羅瀟等[4]分別報道，沙利度胺能明顯抑制博萊霉素誘導的小鼠肺組織I型膠原α1(collagen type I α1,COL1α1)的表達。體外實驗證實，沙利度胺對TGF-β1誘導的人胚肺成纖維細胞系HFLF轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細胞的過程有抑制作用，可抑制α-SMA和Ⅲ型膠原mRNA的表達[18]?？梢?，沙度利胺具有較好的抗肺纖維化作用，然而，其確切的作用機制至今尚未清楚。為進一步了解沙利度胺的抗纖維化作用機制，本研究利用螢光素酶報告基因系統(tǒng)，觀察了沙利度胺對CTGF基因啟動子活性的影響。在本實驗研究中，我們首先構(gòu)建了CTGF啟動子驅(qū)動的螢光素酶報告基因載體pGL3-CTGFP，并將其轉(zhuǎn)染至HELF細胞，以此作為檢測各種測試物對CTGF基因啟動子活性影響的細胞模型。實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pGL3-CTGFP的HELF細胞的螢光素酶活性高于轉(zhuǎn)染空載體pGL3-Basic的細胞，表明CTGF基因在靜息狀態(tài)已有一定水平的表達；而加入TGF-β1后，轉(zhuǎn)染pGL3-CTGFP的HELF細胞的螢光素酶活性明顯增強，此作用呈一定量效和時效關(guān)系，表明TGF-β1確實是上調(diào)CTGF表達的重要因素之一；在此基礎(chǔ)上，我們又觀察到在加入TGF-β1的同時添加沙利度胺，能使CTGF基因啟動子的活性又明顯低于單獨TGF-β1作用下的水平，并呈一定的劑量依賴關(guān)系，這表明沙利度胺對TGF-β1誘導的CTGF啟動子激活效應有明顯的抑制作用，此作用可能與沙利度胺抗纖維化作用有密切關(guān)系，深入探討其作用的分子機制有可能為抗肺纖維化治療提供新的思路。

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