杜會博， 宋 文， 張立民， 邢立強， 張 輝， 趙自剛， 牛春雨

(河北北方學(xué)院微循環(huán)研究所，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 張家口 075029)

由嚴(yán)重感染引起的內(nèi)毒素休克(endotoxic shock，ES)和膿毒癥是臨床常見的危重病理過程，其導(dǎo)致的多器官損傷是導(dǎo)致患者死亡的重要原因之一[1-2]。課題組前期研究表明，來自犬的正常腸淋巴液可有效改善靜脈輸入脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，15 mg/kg)引起的內(nèi)毒素休克大鼠的血液微循環(huán)與淋巴微循環(huán)障礙[3]，改善肝、腎器官的血液灌注量[4]，降低肝、腎組織的黏附分子水平、髓過氧化物酶活性、自由基含量與組織損傷[5-6]；Cheng等[7]的研究也發(fā)現(xiàn)，正常腸淋巴液(normal mesenteric lymph，NML)能降低內(nèi)毒素導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附分子表達(dá)與炎癥反應(yīng)。這些研究均表明，正常腸淋巴液對內(nèi)毒素休克具有一定的干預(yù)作用，可能是未來防治內(nèi)毒素休克的有效藥物靶點，但還需要進(jìn)一步研究其精確的機制。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)在創(chuàng)傷、失血、感染導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控的發(fā)展進(jìn)程中具有重要作用，是引起器官損傷的關(guān)鍵靶點[8]，抑制MAPKs信號通路有利于拮抗內(nèi)毒素的作用[9-10]。但正常淋巴液干預(yù)內(nèi)毒素休克炎癥反應(yīng)與器官損傷的作用是否與MAPKs有關(guān)，還不清楚。為此，本研究觀察正常腸淋巴液對內(nèi)毒素休克小鼠多器官損傷的干預(yù)作用以及MAPKs信號通路主要信號分子p38 MAPK、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinases，ERK)1/2和c-Jun氨基末端蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)磷酸化水平的影響。

材 料 和 方 法

1 動物與分組

36只SPF級BALB/c雄性小鼠[中國食品藥品檢定研究院，許可證號為SCXK(京) 2009-0017]，體質(zhì)量20～25 g。18只小鼠用于正常腸淋巴液引流；另外，18只小鼠隨機均分為：假休克組(sham shock，SS)、內(nèi)毒素休克組(ES)和正常腸淋巴液干預(yù)內(nèi)毒素休克組(NML+ES，簡稱腸淋巴液干預(yù)組)，每組動物6只。實驗過程中動物處置符合動物醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

2 引流正常淋巴液

1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg，北京化學(xué)試劑公司分裝)經(jīng)腹腔注射全身麻醉后，在小鼠腹部正中線偏右作長2 cm縱切口，打開腹腔，暴露腸系膜根部，行腸淋巴管插管，引流腸淋巴液60 min，量在20～60 μL之間，以1 500 r/min離心5 min，去細(xì)胞成分，取上清液(淋漿)置于低溫冰箱-75 ℃冷凍備用。將每3份引流的正常淋巴液混合在一起用于1只內(nèi)毒素休克小鼠的干預(yù)，淋巴液量在100～150 μL之間。

3 建立內(nèi)毒素休克小鼠模型

小鼠經(jīng)戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后，在手術(shù)顯微鏡下，進(jìn)行股部手術(shù)，鈍性分離股動脈，經(jīng)股動脈注射1%肝素鈉(1 mL/kg)全身抗凝后，插管，通過三通管連接RM6240BD型生物信號采集系統(tǒng)(成都儀器廠)，連續(xù)監(jiān)測平均動脈血壓(mean artery pressure，MAP)。手術(shù)完成后穩(wěn)定30 min，內(nèi)毒素休克組與淋巴液干預(yù)組小鼠腹腔注射LPS(O111:B4，Sigma；質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%，35 mg/kg)，復(fù)制內(nèi)毒素休克模型[11]。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報道[12-13]，由于小鼠的股靜脈過細(xì)，故小鼠的輸液治療一般通過股動脈實施；因此，在LPS注射60 min后，淋巴液干預(yù)組小鼠經(jīng)股動脈注射正常淋巴液；結(jié)合課題組前期實驗，正常淋巴液的量為小鼠全血量的1/15(全血量為小鼠體重的1/13)，然后推注少量生理鹽水，確保正常淋巴液全部注入體內(nèi)；內(nèi)毒素休克組僅注射等量的生理鹽水。假休克組小鼠僅實施與內(nèi)毒素休克組、淋巴液干預(yù)組完全相同的手術(shù)，不腹腔注射LPS,不輸入正常淋巴液,只是在相同時點輸入等量生理鹽水。

4 標(biāo)本留取

在腹腔注射LPS后6 h或假休克組相應(yīng)時點，小鼠在麻醉狀態(tài)下，打開腹腔，用1 mL注射器經(jīng)心尖部穿刺進(jìn)入左心室，取血0.5 mL，至EP管，靜置20 min后，以3 000 r/min的速度離心10 min(Labofuge 400R型高速低溫離心機)，留取血漿標(biāo)本于EP管中，置于-75 ℃低溫冰箱，用于反映器官功能的生化指標(biāo)檢測。取血后，迅速留取肺、心臟和肝臟；其中，選擇固定位置的部分肺(左肺葉)、心肌(矢狀切開后的左心室肌)和肝(肝左葉)組織置于4%多聚甲醛中固定，用于組織形態(tài)學(xué)觀察；將余下的肺、心肌、肝組織置于EP管中，-75 ℃凍存(702型低溫冰箱)，用于MAPK信號分子的ELISA檢測。

5 器官組織形態(tài)學(xué)觀察

從多聚甲醛中取出固定的肺、心肌、肝組織，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟(二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各15 min)、脫二甲苯(100%乙醇Ⅰ和100%乙醇Ⅱ各4 min，95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇和75%乙醇各1 min)、水化(自來水3 min)、HE染色(蘇木素染色10 min，自來水洗3次；鹽酸乙醇分化，自來水洗3次，伊紅液染色15 s，自來水洗3次)、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化，應(yīng)用Motic Med 6.0醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)中國有限公司)進(jìn)行拍照。

6 反映器官功能的生化指標(biāo)檢測

應(yīng)用7600-110型全自動生化分析儀(日立)檢測各組小鼠血漿天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)活性以及總膽汁酸(total bile acids，TBA)含量，作為反映肝細(xì)胞損傷與功能的指標(biāo)；檢測乳酸脫氫酶1(lactic acid dehydrogenase 1，LDH-1)、肌酸激酶同工酶(creatine phosphokinase isoenzyme，CK-MB)的活性以及缺血修飾白蛋白(ischemia-modified albumin，IMA)含量，作為心肌細(xì)胞損傷的指標(biāo)。其中，LDH-1采用連續(xù)監(jiān)測法，AST和ALT采用酶法，TBA和CK-MB采用速率法，IMA采用終點法。

7 ELISA分析

取置于-75 ℃凍存的肺、肝、心肌組織，分析天平稱重后，按1∶9比例，加入4 ℃的生理鹽水，在冰浴環(huán)境中，應(yīng)用組織勻漿器制備10%組織勻漿；0～4 ℃、3 000 r/min離心10 min，吸取上清；應(yīng)用小鼠磷酸化的p38 MAPK、ERK1/2和JNK ELISA檢測試劑盒(抗體由美國R&D公司生產(chǎn)、江蘇鎮(zhèn)江厚普生物科技有限公司合成)，繪制p38 MAPK、ERK1/2和JNK標(biāo)準(zhǔn)曲線(分別為：y= 0.008x+0.0000149x2-0.000000079x3，R2= 0.9987；y=0.006x-0.000070x2-0.00000000442x3，R2=0.9966；y=0.004x-0.0000022x2+0.000000000276x3，R2=0.9979)；按試劑盒說明書，檢測各組織勻漿p38 MAPK、ERK1/2和JNK的磷酸化水平；組織勻漿蛋白定量應(yīng)用Bradford法(碧云天生物技術(shù)研究所)。

8 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)或均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理，方差齊的資料多組間比較采用單因素方差分析，兩組間或組內(nèi)相比較應(yīng)用t檢驗；方差不齊的資料采用Kruskal Wallis檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組小鼠平均動脈血壓變化

如圖1所示，實驗過程中，假休克組小鼠血壓基本保持穩(wěn)定；內(nèi)毒素休克組小鼠在腹腔注射LPS后90 min開始下降，尤其在340 min以后下降更為明顯，在90～360 min(除去100 min)均顯著低于假休克組(P<0.05)；腸淋巴液干預(yù)組小鼠血壓亦出現(xiàn)了與內(nèi)毒素休克組小鼠類似的變化，在腹腔注射LPS后110 min開始下降，在110～160 min和260～360 min的各時點顯著低于假休克組(P<0.05)；但腸淋巴液干預(yù)組小鼠血壓在腹腔注射LPS后80 min、90 min、190 min、210 min、240 min、250 min、340 min、350 min和360 min等時點顯著高于內(nèi)毒素休克組(P<0.05)。

Figure 1. Changes of mean artery pressure (MAP) in mice from the sham shock (SS), endotoxic shock (ES), normal mesenteric lymph plus endotoxic shock (NML+ES) groups. Mean±SEM.n=6. *P<0.05 vs SS group; #P<0.05 vs ES group.

2 各組小鼠器官組織形態(tài)學(xué)變化

2.1肺組織形態(tài)學(xué)變化 假休克組小鼠的肺泡壁薄，結(jié)構(gòu)基本正常，表面被覆肺泡上皮細(xì)胞，肺泡腔內(nèi)無明顯滲出物，見圖2A、B；內(nèi)毒素休克組小鼠肺泡間隔有增寬的表現(xiàn)，可見炎細(xì)胞浸潤和單核細(xì)胞增生，肺泡腔內(nèi)偶見有滲出的紅細(xì)胞，見圖2C、D；腸淋巴液干預(yù)組小鼠肺組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)與內(nèi)毒素休克組相似，但肺泡間隔較窄，炎癥細(xì)胞浸潤程度較輕，見圖2E、F。

Figure 2. Changes of pulmonary pathomorphology in mice (HE staining; A, C, and E: ×100; B, D and F: ×400). A and B: sham shock group; C and D: endotoxic shock group; E and F: normal mesenteric lymph plus endotoxic shock group.

2.2肝組織形態(tài)學(xué)變化 假休克組小鼠肝索呈放射狀排列，血竇寬度基本正常，肝細(xì)胞排列正常，肝細(xì)胞核圓、居中，核仁明顯，核膜清晰，可見雙核，胞漿染色嗜酸、均質(zhì)，見圖3A、B；內(nèi)毒素休克組小鼠的肝細(xì)胞排列稍紊亂，偶見水腫，見圖3C、D；腸淋巴液干預(yù)組小鼠肝細(xì)胞損傷程度較內(nèi)毒素休克組輕，肝小葉周邊細(xì)胞可見輕度水腫，見圖3E、F。

2.3心肌組織形態(tài)學(xué)變化 假休克組小鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，核居中，核膜清晰，心肌細(xì)胞大小較一致，心肌纖維排列正常，見圖4A、B；內(nèi)毒素休克組小鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，偶見心肌細(xì)胞水腫，見圖4C、D；腸淋巴液干預(yù)組小鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，見圖4E、F。

Figure 3. Changes of hepatic pathomorphology in mice (HE staining; A, C, and E: ×100; B, D and F: ×400). A and B: sham shock group; C and D: endotoxic shock group; E and F: normal mesenteric lymph plus endotoxic shock group.

3 各組小鼠器官功能生化指標(biāo)的變化

3.1反映肝細(xì)胞壞死與功能的生化指標(biāo)變化 內(nèi)毒素休克組小鼠血漿AST和ALT含量顯著高于假休克組(P<0.05)；腸淋巴液干預(yù)組小鼠血漿AST含量顯著低于內(nèi)毒素休克組(P<0.05)，與假休克組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；3組小鼠血漿TBA含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 正常淋巴液對內(nèi)毒素休克小鼠肝功能生化指標(biāo)的影響

3.2反映心肌細(xì)胞壞死的生化指標(biāo)變化 內(nèi)毒素休克組與腸淋巴液干預(yù)組小鼠血漿CK-MB活性均顯著高于假休克組(P<0.05)；且腸淋巴液干預(yù)組小鼠血漿LDH-1活性顯著低于內(nèi)毒素休克組(P<0.05)；3組小鼠血漿IMA水平未見顯著差異(P>0.05)，見表2。

表2 正常淋巴液對內(nèi)毒素休克小鼠心肌生化指標(biāo)的影響

4 各組小鼠器官MAPKs信號分子的變化

與假休克組比較，內(nèi)毒素休克組小鼠肺組織p38 MAPK、ERK1/2和JNK磷酸化水平顯著增高(P<0.05)；心肌組織p38 MAPK、ERK1/2和JNK磷酸化水平有增高的趨勢，但無顯著差異(P>0.05)；肝組織p38 MAPK、ERK1/2和JNK磷酸化水平無顯著差異(P>0.05)。輸入正常腸淋巴液降低了內(nèi)毒素休克小鼠肺組織的p38 MAPK磷酸化水平以及心肌組織的p38 MAPK、ERK1/2和JNK磷酸化水平(P<0.05)，見表3～5。

表3 正常淋巴液對內(nèi)毒素休克小鼠多器官磷酸化p38 MAPK水平的影響

表4 正常淋巴液對內(nèi)毒素休克小鼠多器官磷酸化ERK1/2水平的影響

表5 正常淋巴液對內(nèi)毒素休克小鼠多器官磷酸化JNK水平的影響

討 論

內(nèi)毒素休克模型的建立有多種方法，如靜脈輸入LPS或菌液[14-15]、腹腔注射LPS或菌液[11-13, 16]，也有盲腸結(jié)扎穿孔的方法[17-18]，每一種模型均有一定的代表性和臨床意義。為了進(jìn)一步探討正常腸淋巴液對內(nèi)毒素休克的干預(yù)作用機制，本文在已證實正常腸淋巴液對靜脈輸入LPS導(dǎo)致內(nèi)毒素休克大鼠模型具有良好干預(yù)作用的基礎(chǔ)上，應(yīng)用腹腔注射LPS這一更符合臨床實踐的方法建立了內(nèi)毒素休克小鼠模型。在腹腔注射LPS建立內(nèi)毒素模型的過程中，國內(nèi)外學(xué)者使用LPS的劑量有所不同，有5～120 mg/kg。我們分析可能與動物種類不同、LPS來源的菌株不同或作者本身要觀察內(nèi)毒素休克的程度不同有關(guān)。Li等[11]分別腹腔注射大劑量(35 mg/kg)和小劑量(10 mg/kg)LPS建立內(nèi)毒素休克小鼠模型，發(fā)現(xiàn)小劑量組動物的存活率為90%(僅有1只在30 h死亡)，而大劑量組動物在注射LPS后的25 h內(nèi)全部死亡。Noworyta-Sokoowska等[16]以10 mg/kg的劑量腹腔注射LPS，提高了羥自由基的產(chǎn)生，但并沒有引起細(xì)胞外多巴胺(dopamine，DA)、谷氨酸鹽(glutamate，GLU)和腺苷酸(adenosine，ADN)水平增高；反復(fù)給予5次(5 mg/kg)腹腔注射，則提高了細(xì)胞上DA、GLU和ADN的水平。

結(jié)合這些文獻(xiàn)結(jié)果，本研究以腹腔注射35 mg/kg LPS建立了小鼠內(nèi)毒素休克模型。腹腔注射LPS后90～360 min的多個時點MAP顯著低于假休克組，也出現(xiàn)了內(nèi)毒素休克較典型的血壓變化，即：先下降，后緩慢回升，繼續(xù)下降至較低水平(尤其是在340 min以后)。從肺、肝和心肌的組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果來看，各器官出現(xiàn)了一定的但并不重的結(jié)構(gòu)損傷；從反映器官功能或損傷的生化指標(biāo)來看，在LPS注射后6 h，小鼠血漿AST、ALT和CK-MB活性顯著增強。MAP、器官形態(tài)與生化指標(biāo)的結(jié)果證明了本實驗中所用的內(nèi)毒素休克模型是成功的。但是也應(yīng)看到，在LPS注射后6 h，MAP雖然有所下降，但在60 mmHg左右；器官組織結(jié)構(gòu)有了一定的損傷，生化指標(biāo)有了一些改變，但損傷程度較輕；同時，血漿TBA、IMA等指標(biāo)均未見明顯差異。這說明，本研究所用模型是比較輕的一種內(nèi)毒素休克模型，如果延長觀察時間，可能會看到較為嚴(yán)重的損傷情況。同時，本實驗中，在觀察LPS注射后的6 h內(nèi)，內(nèi)毒素休克組與腸淋巴液干預(yù)組小鼠均全部存活；至于該模型小鼠的存活時間以及輸入正常腸淋巴液對內(nèi)毒素休克小鼠存活時間的影響，還有待進(jìn)一步觀察。

本研究也觀察到，腹腔注射LPS并給予腸淋巴液后，MAP在注射LPS后80 min、90 min、190 min、210 min、240 min、250 min、340 min、350 min和360 min顯著高于內(nèi)毒素休克組；同時，在腹腔注射LPS后6 h，腸淋巴液干預(yù)組小鼠肺、肝和心肌的組織學(xué)損傷程度是輕的，且血漿AST和LDH-1活性低于內(nèi)毒素休克組。這些結(jié)果表明，同源正常腸淋巴液對腹腔注射LPS導(dǎo)致的內(nèi)毒素小鼠具有一定的干預(yù)作用。同時也應(yīng)該注意到，在280～330 min內(nèi)的各時點，腸淋巴液干預(yù)組與內(nèi)毒素休克組小鼠的MAP比較接近，沒有顯著差異。究其原因，一方面可能是機體損傷與抗損傷作用斗爭的結(jié)果；另一方面也說明正常腸淋巴液抗內(nèi)毒素的作用具有一定的局限性，也可能與輸入正常腸淋巴液的時間有關(guān)，器官組織學(xué)損傷的變化也能表明這一點。

已有的研究表明，MAPKs信號通路可通過G蛋白偶聯(lián)受體[19]、Toll樣受體[20]等多種途徑在LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)中具有重要作用；下調(diào)MAPKs信號可降低炎癥反應(yīng)[21-22]。目前，已知MAPKs信號通路的關(guān)鍵信號分子有p38 MAPK、ERK1/2和JNK，故本研究從這3個關(guān)鍵信號分子的磷酸化水平探討了正常腸淋巴液干預(yù)內(nèi)毒素休克的作用機制。結(jié)果顯示，小鼠注射LPS后6 h，肺組織p38 MAPK、ERK 1/2和JNK的磷酸化水平顯著增高，提示內(nèi)毒素休克引起的肺損傷可能與MAPKs的磷酸化水平增高有關(guān)，這與相關(guān)報道是一致的[23-24]；而腸淋巴液干預(yù)降低了內(nèi)毒素休克小鼠肺組織的p38 MAPK的磷酸化水平，提示腸淋巴液干預(yù)內(nèi)毒素休克肺損傷的機制可能與p38 MAPK有關(guān)；但具體機制還需要進(jìn)一步研究。

目前的研究表明，LPS引起的肝和心肌損傷與p38 MAPK和JNK的磷酸化水平增高有關(guān)[25-27]。但本文的研究結(jié)果顯示，內(nèi)毒素休克小鼠心肌和肝組織p38 MAPK、ERK 1/2和JNK的磷酸化水平未出現(xiàn)顯著變化，這可能與本實驗觀察的時間過短有關(guān)，也可能與腹腔注射LPS的劑量有關(guān)。盡管內(nèi)毒素休克并未引起小鼠心肌組織p38 MAPK、ERK 1/2和JNK的磷酸化水平出現(xiàn)明顯變化，但輸入正常腸淋巴液降低了心肌組織三者的磷酸化水平，這將有利于降低MAPKs介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，但這還需要進(jìn)一步延長實驗時間來驗證。

我們前期實驗表明，在靜脈注射LPS后6 h血壓降到60 mmHg左右[3-4]；而相關(guān)文獻(xiàn)報道，在血壓降低初始血壓的1/3以上時，視為出現(xiàn)了內(nèi)毒素休克[24, 28]，故在本實驗中，我們選擇了在腹腔注射LPS后6 h觀察肺、心、肝等組織器官結(jié)構(gòu)以及MAPKs磷酸化水平的變化。但在本實驗中，在腹腔注射LPS后的60 min內(nèi)，MAP維持在80～90 mmHg的一個較高范圍內(nèi)，其主要原因可能是注射至腹腔的LPS轉(zhuǎn)移到血液循環(huán)需要一定時間，與靜脈注射LPS引起的血壓變化不同。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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