儲(chǔ)永良, 黃清春, 黃閏月, 晏靖遙， 陳秀敏， 徐偵雄

(廣東省中醫(yī)院, 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院風(fēng)濕科, 廣東 廣州 510006)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA) 所致的關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞過(guò)度增殖，從而導(dǎo)致軟骨、骨和韌帶等結(jié)構(gòu)的破壞，是重要的病理生理過(guò)程[1]。在治療方面，包括環(huán)氧酶2抑制劑(cyclooxygenase-2 inhibitors, COXIBs)在內(nèi)的非甾體抗炎藥物(nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)如賽來(lái)昔布是RA治療的一線藥物，與改善RA病情藥(disease-modifying antirheumatic drugs，DMARDs)聯(lián)用可有效控制關(guān)節(jié)炎癥，減輕疼痛，改善病情。但是NSAIDs的長(zhǎng)期應(yīng)用存在誘發(fā)心血管事件的潛在風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致治療并發(fā)心血管疾病的RA患者時(shí)的藥物選擇困境[2]。近年來(lái)，靶向COX-2下游通路的研究逐漸開(kāi)展，作為COX-2下游的主要產(chǎn)物之一，血栓素A2(thrombo-xane A2,TXA2)在腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、部分炎癥細(xì)胞等眾多細(xì)胞類型中都被廣泛證實(shí)可以通過(guò)與其功能受體(TXA2R)相結(jié)合，進(jìn)而激活多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲等生物學(xué)行為[3-4]。TXA2R屬于G蛋白偶聯(lián)受體，該類受體是RA治療的重要靶點(diǎn)[5]，有望通過(guò)此靶點(diǎn)找到臨床療效顯著而最小副作用的消炎鎮(zhèn)痛藥物。

材 料 和 方 法

1 材料

RA關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞株MH7A購(gòu)自RIKEN生物資源中心(http://www.brc.riken.jp/lab/cell/english/)。MH7A是由RA患者的滑膜成纖維細(xì)胞經(jīng)SV40T抗原基因轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)化而成的永生化細(xì)胞株[6]。COX-2 siRNA 購(gòu)自O(shè)riGene；TXA2R激動(dòng)劑U46619和拮抗劑SQ29548均購(gòu)自Cayman Chemical； MTS試劑盒與cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均為Promega，而BrdU細(xì)胞增殖檢測(cè)ELISA試劑盒則購(gòu)自Roche Applied Science；TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen； SYBR Green Real-Time PCR 試劑盒購(gòu)自Bio-Rad，相對(duì)應(yīng)的real-time PCR檢測(cè)儀為Bio-Rad新一代的 CFX96 TouchTMDeep Well Real-Time PCR 檢測(cè)系統(tǒng)。

用于細(xì)胞培養(yǎng)的試劑：胎牛血清、雙抗(1×105U/L 青霉素和100 mg/L鏈霉素)和DMEM培養(yǎng)基均為Gibco生產(chǎn)；用于細(xì)胞消化傳代的胰蛋白酶(含EDTA)購(gòu)自HyClone；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)為R&D Systems產(chǎn)品。

2 方法

2.1MH7A細(xì)胞的培養(yǎng) MH7A細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中。每2～3 d 更換新鮮培養(yǎng)基，一般經(jīng)過(guò)3 d 時(shí)間細(xì)胞在培養(yǎng)皿中可達(dá)到90%覆蓋，此時(shí)用含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的消化液消化，按1∶3傳代。

2.2加藥干預(yù) MH7A細(xì)胞以每孔2×106加入多個(gè)6孔板, 并加入20 μg/L TNF-α刺激細(xì)胞以模擬RA患者關(guān)節(jié)滑膜組織微環(huán)境。細(xì)胞種板后置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，經(jīng)24 h待細(xì)胞貼板后, 設(shè)置空白對(duì)照組、U46619不同劑量組和SQ29548不同劑量組，分別給予不同濃度相應(yīng)藥物進(jìn)行干預(yù)。每24 h換液、換藥1次，培養(yǎng)條件同前。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，各實(shí)驗(yàn)重復(fù)不少于3次。

2.3mRNA提取、RNA逆轉(zhuǎn)錄和real-time PCR 收集藥物干預(yù)后的細(xì)胞，按TRIzol試劑說(shuō)明書，提取和純化各樣本的mRNA。以A260/A280比值接近2.0作為純化標(biāo)準(zhǔn)。T7-Oligo(dT)作為引物使mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第1鏈，RNase H介導(dǎo)cDNA第2鏈的合成，操作按照Promega公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書。cDNA作為real-time PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的模板，β-actin作為看家基因。按照SYBR Green Real-Time PCR 試劑盒說(shuō)明書構(gòu)建反應(yīng)體系，在定量PCR用96孔板中加入 SuperMix、cDNA和引物，用去RNase水配平每孔，然后上機(jī)運(yùn)作CFX96 TouchTMDeep Well Real-Time PCR 檢測(cè)系統(tǒng)。數(shù)據(jù)按照2-ΔΔCT方法處理。

所用引物：人COX-2上游引物5’-TTCCTCCTGTGCCTGATG-3’，下游引物5’-CTGATGCGTGAAGTGCTG-3’；人β-actin上游引物5’-GGAAATCGTGCGTGACATT-3’，下游引物5’-CAGGCAGCTCGTAGCTCTT-3’。反應(yīng)條件： 95 ℃ 10 min起始模板變性，然后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。

2.4siRNA轉(zhuǎn)染 細(xì)胞接種于6孔板，用不含雙抗的培養(yǎng)基培養(yǎng)。用20 μg/L TNF-α預(yù)處理24 h后，按照Origene轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書操作，將2 μg non-target siRNA(control siRNA)和COX-2 siRNA分別轉(zhuǎn)入細(xì)胞，18 h后更換不含雙抗的新鮮培養(yǎng)基并繼續(xù)TNF-α刺激，此時(shí)可進(jìn)行藥物處理等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.5MTS與BrdU細(xì)胞增殖檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明書操作。酶標(biāo)儀讀值，MTS檢測(cè)在492 nm波長(zhǎng)下讀取活細(xì)胞數(shù)，而BrdU檢測(cè)則以595 nm 為參照在450 nm波長(zhǎng)下讀值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次后取各組均數(shù)，細(xì)胞增殖率(%)=實(shí)驗(yàn)組平均數(shù)/空白對(duì)照組平均數(shù)×100%。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示, SPSS 16.0軟件處理。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較則采用單因素方差分析的Dunnett’s檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TXA2R拮抗劑可有效抑制RA滑膜細(xì)胞的增殖

MTS實(shí)驗(yàn)證實(shí)，特異性TXA2R拮抗劑SQ29548可有效抑制MH7A細(xì)胞的增殖，并且隨著劑量的加大和時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑制效應(yīng)越明顯，見(jiàn)圖1A。在最小濃度0.1 μmol/L時(shí)，SQ29548處理MH7A細(xì)胞72 h后，與對(duì)照組比較其抑制效率達(dá)到(47.1±8.9)%，差異顯著(P<0.05)。而5 μmol/L SQ29548處理MH7A細(xì)胞24 h后，細(xì)胞增殖抑制率的差異達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(57.8%±5.3%，P<0.05)，處理48 h后為(36.4±5.5)%(P<0.01)，處理72 h 后為(24.8±5.1)%(P<0.01)。因?yàn)? μmol/L SQ29548在多種體外細(xì)胞株中均被證實(shí)可有效引起細(xì)胞生物學(xué)行為改變[3]，因此5 μmol/L作為最適SQ29548藥物濃度被應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 TXA2R激動(dòng)劑具有增強(qiáng)RA滑膜細(xì)胞增殖的作用

如圖1B所示，TXA2R激動(dòng)劑U46619在0.1 μmol/L和5 μmol/L范圍內(nèi)可有效增強(qiáng)MH7A細(xì)胞的增殖能力，且呈時(shí)間依賴性。5 μmol/L U46619處理MH7A細(xì)胞24 h后，細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)，細(xì)胞增殖率與對(duì)照組比較達(dá)(145.8±10.4)%，有顯著差異(P<0.05)。處理48 h后，細(xì)胞增殖率達(dá)(188.6±8.2)%(P<0.01)，72 h后高達(dá)(243.6±7.6)%(P<0.01)。

Figure 1. The effects of TXA2R antagonist SQ29548 (A) and agonist U46619 (B) on the MH7A cell proliferation.Mean±SD.n=4.*P<0.05, **P<0.01 vs control (0 μmol/L).

3 TXA2R抑制劑和激動(dòng)劑對(duì)COX-2 mRNA的表達(dá)影響

分別用5 μmol/L的SQ29548和U46619處理MH7A細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后行SYRB Green real-time PCR檢測(cè)。如圖2所示，SQ29548可有效抑制COX-2 mRNA表達(dá)，COX-2 mRNA的表達(dá)量是對(duì)照組的0.42倍(P<0.01)。相反的，U46619顯著上調(diào)了COX-2 mRNA的表達(dá)，與對(duì)照組比較，COX-2 mRNA的表達(dá)量達(dá)2.21倍(P<0.01)。結(jié)果說(shuō)明TXA2R抑制劑和激動(dòng)劑可顯著干預(yù)COX-2 mRNA表達(dá)，提示在RA關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞中TXA2R可一定程度上控制COX-2的表達(dá)。

Figure 2. The effects of TXA2R antagonist and agonist on COX-2 mRNA expression.Mean±SD.n=4.**P<0.01 vs control.

4 在COX-2沉默的情況下，U46619可一定程度上重建受損的細(xì)胞增殖力

圖3A表明COX-2 siRNA轉(zhuǎn)染MH7A細(xì)胞后可有效抑制COX-2 mRNA的表達(dá)。在control siRNA轉(zhuǎn)染組中，1 μmol/L的U46619刺激48 h后對(duì)細(xì)胞增殖力的影響與MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，見(jiàn)圖3B、1B。如圖3B顯示，COX-2 siRNA轉(zhuǎn)染72 h后，細(xì)胞增殖率為(38.0±10.6)% (P<0.01)，與對(duì)照組相比，顯著降低。但用U46619刺激后細(xì)胞增殖能力顯著恢復(fù)，甚至接近對(duì)照組水平。這些結(jié)果表明，作為COX-2的下游產(chǎn)物，TXA2通過(guò)TXA2R介導(dǎo)了COX-2在RA滑膜細(xì)胞中的的細(xì)胞增殖效應(yīng)。

討 論

在機(jī)體中COX-2是一種誘導(dǎo)性酶，主要在炎癥部位釋放。目前，COXIBs聯(lián)合DMARDs已經(jīng)在RA臨床治療中被廣泛應(yīng)用，而且DMARDs也被證實(shí)部分地通過(guò)抑制COX-2的活性來(lái)發(fā)揮抗炎作用的[7]。但COXIBs 由于不能有效抑制內(nèi)皮細(xì)胞源性的TXA2，從而增加了心血管事件的發(fā)生率。這種安全隱患導(dǎo)致了Rofecoxib從藥物市場(chǎng)的撤離，也引起風(fēng)濕病與鎮(zhèn)痛領(lǐng)域的研究者關(guān)注 COX-2下游產(chǎn)物[8]。

在RA關(guān)節(jié)腔微環(huán)境中，滑膜細(xì)胞和核微血管中的血小板在炎癥因子的刺激下均可產(chǎn)生TXA2[9]。早期的臨床研究就從關(guān)節(jié)滑膜組織和尿液檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，相較于正常組織和健康志愿者，RA患者表達(dá)更高水平的TXA2[10-11]。而最近一項(xiàng)對(duì)54個(gè)RA患者和20例健康對(duì)照組的臨床研究表明，在RA患者尿液中檢測(cè)出的TXA2代謝產(chǎn)物是健康志愿者的近2倍，并且不受生物制劑如TNF-α阻斷劑的影響[12]。這也許可以部分地解釋單用生物制劑并不能達(dá)到傳統(tǒng)DMARDs長(zhǎng)期療效的現(xiàn)象。

Figure 3. TXA2R agonist recovered cell proliferative ability impaired by COX-2 siRNA.A: COX-2 siRNA significantly suppressed COX-2 mRNA expression; B: BrdU cell proliferation assay.Mean±SD.n=4.*P<0.05, **P<0.01 vs control siRNA alone; ##P<0.01 vs COX-2 siRNA alone.

本研究發(fā)現(xiàn)，TXA2R拮抗劑SQ29548可以時(shí)間和劑量依賴性地抑制TNF-α刺激條件下滑膜細(xì)胞的生長(zhǎng)。相反的，TXA2R激動(dòng)劑U46619則進(jìn)一步促進(jìn)滑膜細(xì)胞的增殖能力。這些結(jié)果充分說(shuō)明TXA2在RA滑膜腫瘤樣增生病理中可通過(guò)其受體發(fā)揮正調(diào)節(jié)作用。當(dāng)劑量達(dá)到10 μmol/L時(shí)，U46619促細(xì)胞增殖的效應(yīng)反而下降，可能是因?yàn)榧?dòng)劑與受體的結(jié)合已經(jīng)達(dá)到飽和。U46619本身是一種TXA2的模擬物，通過(guò)與TXA2R的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合來(lái)發(fā)揮作用，因此當(dāng)達(dá)到最大結(jié)合率時(shí)，藥效達(dá)到頂峰，更大劑量的U46619并不能發(fā)揮更多的作用，反而可能會(huì)引起未知的額外效應(yīng)，有待進(jìn)一步研究闡明。我們最近在腫瘤細(xì)胞體外模型中發(fā)現(xiàn)TXA2R可以通過(guò)一條從細(xì)胞膜與核內(nèi)外的自我激活途徑控制COX-2的表達(dá)并持續(xù)刺激細(xì)胞增殖，并且在COX-2下游產(chǎn)物中，TXA2是COX-2促細(xì)胞增殖效應(yīng)的關(guān)鍵傳遞者[3]。滑膜細(xì)胞腫瘤樣的病理特征提示我們有必要驗(yàn)證TXA2R自我激活途徑在RA體外模型中的有效性。我們的結(jié)果表明，TXA2或者說(shuō)TXA2R在RA滑膜細(xì)胞中也可以控制COX-2的表達(dá)。當(dāng)用siRNA方法沉默COX-2后，RA滑膜細(xì)胞的增殖衰減支持了現(xiàn)有COXIBs在RA中的應(yīng)用。重要的是，U46619幾乎可以重建受損的細(xì)胞增殖力，也就是說(shuō)TXA2的功能補(bǔ)充可以恢復(fù)因COX-2受抑制而衰減的細(xì)胞增殖能力，明確說(shuō)明TXA2及其受體就是COX-2在RA滑膜細(xì)胞中的關(guān)鍵效應(yīng)傳遞者。

綜合分析，我們的研究結(jié)果支持TXA2在RA發(fā)病機(jī)制中的重要作用。而且，我們還在RA滑膜細(xì)胞中驗(yàn)證了TXA2的功能自我調(diào)節(jié)機(jī)制，即TXA2通過(guò)其特異性受體TXA2R既可以控制其上游關(guān)鍵酶COX-2的產(chǎn)生，實(shí)現(xiàn)TXA2生成的正反饋調(diào)節(jié)，又可以有效傳遞COX-2的病理學(xué)效應(yīng)，促進(jìn)滑膜細(xì)胞的異常增殖。我們的研究說(shuō)明，靶向TXA2及其受體有望發(fā)現(xiàn)新的RA治療藥物，進(jìn)一步改善現(xiàn)有的治療方案。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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