阮 萍， 肖 健， 楊 春， 蘇建家， 歐 超， 曹 驥， 駱成漂， 唐艷萍， 秦 虹,2， 孫 雯,2， 李 瑗△

(1廣西腫瘤醫(yī)院實驗研究部，廣西 南寧 530021； 2廣西醫(yī)科大學研究生院，廣西 南寧 530021；3廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院病理科， 廣西 南寧 530011； 4廣西中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，廣西 南寧 530001)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是全球面臨的重大公共衛(wèi)生問題，是引起急慢性肝炎、肝硬化及肝癌的主要病因。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，全球現(xiàn)有慢性HBV感染者2.4億；全世界每年約有60萬患者死于HBV感染相關的肝硬化及肝癌[1]?？莘窦毎?Kupffer cells)是定居于肝臟的巨噬細胞，可監(jiān)視肝臟環(huán)境，并可能通過其胞漿、胞膜受體激活并介導吞噬病毒以及通過參與調節(jié)適應性免疫等方式，在控制HBV復制及抗病毒方面起重要作用[2]。

樹鼩與人類親緣關系密切，已逐漸被認識到是一種新型的有巨大開發(fā)潛力的實驗動物。以往的研究表明不僅樹鼩的原代肝細胞能體外感染HBV，同時樹鼩體內也能感染HBV[3]。本課題組近年來關于新生樹鼩感染HBV的研究表明，新生期接種HBV的樹鼩能夠長期感染HBV，并且HBV能夠在樹鼩體內穩(wěn)定復制和長期存在[4]。本研究在課題組以往研究的基礎上，通過對慢性感染HBV樹鼩肝組織進行枯否細胞數(shù)量及功能的檢測，以探索枯否細胞在樹鼩感染HBV慢性化過程中的可能作用。

材 料 和 方 法

1 動物

繁殖用的野生成年樹鼩購自中國科學院昆明動物研究所；本課題所用樹鼩為以上動物在本實驗室經人工繁育的后代。動物飼養(yǎng)環(huán)境和方法見以往報道[5]。

參照臨床上慢性HBV感染者的診斷標準[6]，本研究對自然壽命6～8年的樹鼩設定的慢性感染標準為血清乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B virus surface antigen，HBsAg)陽性、血清和(或)肝組織HBV DNA陽性超過24周；而“疑似慢性感染”則指動物在接種后48周或更長的期間，上述標志物2次以上顯示陽性，并且此期間血清乙型肝炎病毒表面抗體(hepatitis B virus surface antibody，HBsAb)為持續(xù)陰性或僅在接種后早期偶為陽性。根據(jù)感染情況將樹鼩分為3組：A組(n=6):為已確認慢性感染HBV的樹鼩(感染時間為89～324周)；B組(n=6):為疑似慢性感染HBV的樹鼩(感染時間為171～229周)；C組(n=4):正常對照樹鼩，即從未接種HBV，血清HBsAg、HBsAb及HBV DNA皆為陰性。

2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清為HyClone產品；Percoll液、牛胰島素及肝素鈉為Sigma產品；β-巰基乙醇為Amresco產品；膠原酶Ⅳ及熒光定量PCR試劑盒為Life Technologies產品；鼠抗人CD163和兔抗人溶菌酶(lysozyme)多克隆抗體、PV9000兩步法免疫組化檢測試劑盒及濃縮型DAB染色試劑盒均為北京中杉金橋生物技術公司產品；熒光素PE標記抗CD163抗體和熒光素PE標記鼠IgG為eBioscience產品；印度墨汁為國藥集團化學試劑有限公司產品；溶酶體紅色熒光探針為上海碧云天生物技術有限公司產品；RNA提取試劑盒為北京天根生化科技有限公司產品；其它常用試劑均為國產分析純試劑。所用引物由上海捷瑞生物工程有限公司根據(jù)www.ncbi.nlm.gov數(shù)據(jù)庫中國樹鼩GAPDH及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)mRNA序列設計合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

3 主要方法

3.1標本收集 定期對樹鼩行剖腹取肝組織活檢手術，每6～12月1次。肝活檢組織一部分經10%中性甲醛固定和石蠟包埋后作免疫組織化學檢查，另一部分用以分離枯否細胞。

3.2樹鼩枯否細胞分離、純化及培養(yǎng) 在切取的肝組織塊邊緣處剪2～3個小切口，用裝滿D-Hanks液的注射器插入血管斷端內緩慢沖洗，隨后注入事先在37 ℃預熱的含0.1%膠原酶IV的消化緩沖液對肝組織進行消化，至肝組織變軟、輪廓塌陷；剪碎未徹底消化的肝組織至呈糊狀；所有肝組織消化物37 ℃水浴振蕩1.5 h；過200目細胞篩，即得到肝細胞懸液；肝細胞懸液用差速離心法分離肝非實質細胞；用30%/70% Percoll液梯度密度離心法進一步分離出以枯否細胞為主的肝非實質細胞(該處分離的肝非實質細胞用于流式細胞術檢測)；沉淀的細胞用枯否細胞培養(yǎng)液(10% 胎牛血清10 mL、1% 青-鏈霉素復合液、1 mmol/L β羥基乙醇和0.001% 胰島素)重懸，然后分別接種于培養(yǎng)瓶或鋪好蓋玻片的六孔板內；培養(yǎng)30 min后用DMEM輕輕洗去未貼壁的細胞以純化枯否細胞；重新加入培養(yǎng)液，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)12 h。臺盼藍染色判斷細胞活性；聯(lián)合應用墨汁吞噬實驗、CD163及溶菌酶免疫細胞化學染色和透射電鏡觀察等方法鑒定枯否細胞[7]。

3.3流式細胞術檢測 肝非實質細胞經Percoll梯度密度分離后，收集約1×106個細胞用流式細胞緩沖液重懸；加入熒光素PE標記抗CD163抗體，輕柔吹打混勻；取自正常對照組動物的枯否細胞懸液2管，分別加入熒光素PE標記鼠IgG或PBS，作為同型對照及空白對照；避光4 ℃孵育40 min；使用BD LSRll型流式細胞儀，PE通道電壓設置為350 V，收集1×105個細胞；首先上樣同型對照管，根據(jù)前向角散射(forward angle scatter，F(xiàn)SC)及側向角散射(side angle scatter，SSC)圈定待測細胞群，并在相應的熒光直方圖中調出陰性對照標本，劃定陰性與陽性細胞界標，使陰性細胞的假陽性率<1%，再以SSC/CD163-PE雙參數(shù)設門，檢測各管中CD163+細胞的光散射和熒光強度。

3.4免疫組織化學染色 切片經二甲苯脫蠟及梯度乙醇至水化；按抗體說明書進行檸檬酸鹽高溫高壓修復；3%H2O2抑制內源性過氧化物酶；滴加適當濃度的I抗工作液，4 ℃冰箱孵育過夜；按試劑盒說明書的兩步法滴加II抗；滴加DAB顯色。對照設計：每批染色分別用I抗說明書建議的組織切片作為陽性對照；以非免疫正常小鼠血清代替I抗作為陰性對照；空白對照以PBS代替I抗。染CD163和溶菌酶的切片根據(jù)陽性細胞的數(shù)量進行評分，方法：每例切片分別隨機取10個高倍視野(×400)，計數(shù)其中的陽性細胞個數(shù)，取平均值[8]。以上所有染色結果的評判均采用統(tǒng)一標準和雙盲法，由2名研究者分別閱片、評分。

3.5枯否細胞溶酶體檢測 用細胞培養(yǎng)液配制溶酶體探針LysoTracker Red工作液，使其最終濃度為50 nmol/L，使用前用37 ℃水浴預溫；細胞培養(yǎng)12 h后，去除細胞培養(yǎng)液，加入LysoTracker Red染色工作液，37 ℃孵育60 min；去除LysoTracker Red染色工作液，加入新鮮的細胞培養(yǎng)液，在熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照；每個培養(yǎng)皿分別隨機觀察5個高倍視野(×400)，選擇手動曝光以保證每張照片的曝光時間相同；用Image-Pro Plus 6.0軟件進行陽性細胞計數(shù)及熒光強度分析，細胞平均熒光強度即平均吸光度=總吸光度/陽性細胞數(shù)，取5個高倍視野的平均值[9]。

3.6實時熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative RT-PCR，real-time RT-PCR)檢測枯否細胞TNF-α mRNA表達水平 細胞培養(yǎng)12 h后，加入消化酶消化并收集細胞；引物序列見表1。采用RNA提取試劑盒提取總mRNA；用蛋白核酸定量儀測定總RNA的濃度和純度，將樣品的總RNA濃度稀釋調整為1 g/L；參照RevertAidTMFirst Strand cDNA合成試劑盒實驗操作說明，以Oligo(dT)18為引物進行逆轉錄；使用SYBR Select Master Mix熒光實時RT-PCR試劑盒，擴增反應在ABI 7300 System上進行，反應條件：95 ℃ 15 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 40 s，40個循環(huán)；用7300 System SDS Software 1.2.3分別構建TNF-α和GAPDH的標準曲線，并設置標準品的梯度稀釋拷貝數(shù)；PCR擴增結束后，分析儀顯示標準曲線、擴增曲線和熔解曲線，每個樣本取3次獨立實驗數(shù)據(jù)的平均值；凝膠圖像分析系統(tǒng)(Gel-Pro Analyzer 3.0)分析目的基因與看家基因GAPDH條帶吸光度的比值。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示；組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗(Mann-Whitney Test),以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 肝臟非實質細胞中枯否細胞的比例及肝內枯否細胞計數(shù)

以FSC和SSC設門，在熒光直方圖上觀察到A、B、C 3組均可見2個獨立細胞亞群即P1及P2亞群，其中P1亞群細胞FSC值較大。已知枯否細胞在肝臟主要的非實質細胞中體積最大，直徑為12 μm[10]，故可確認P1亞群即為以枯否細胞為主的肝臟非實質細胞，而P2亞群可能為其它體積較小的肝臟非實質細胞。將P1亞群圈定，再用SSC通道結合PE熒光標記CD163通道設門，可見CD163+的細胞群(P)，見圖1。

CD163陽性染色定位于胞漿，呈顆粒狀棕黃色。A組的陽性細胞主要位于肝細胞壞死灶周圍，或聚集于匯管區(qū)炎癥灶內；B組和C組的CD163陽性細胞主要分布于匯管周的肝竇內。

結果顯示，A組CD163+細胞在分離的肝非實質細胞中所占比例及在肝組織內的數(shù)量均高于B組及C組(P<0.05)，而B組及C組間的差異無統(tǒng)計學意義，見圖1及表2。

Figure 1. Flow cytometry assay (upper) and immunohistochemical staining (×200; lower) of Kupffer cells in tree shrew livers. P1: the non-parenchymal liver cells, the majority of which were Kupffer cells; P2: the other non-parenchymal liver cells exclusive of Kupffer cells; P: CD163+ Kupffer cells. A: group A, identified as persistently infected with HBV; B: group B, suspected as persistently infected with HBV; C: group C, not inoculated with HBV.

表2 樹鼩肝內CD163標記枯否細胞的比例及數(shù)量

2 枯否細胞的溶酶體個數(shù)及溶菌酶表達

在倒置熒光顯微鏡下觀察到LysoTracker Red熒光探針標記的溶酶體顆粒位于枯否細胞的胞漿中。A組細胞溶酶體的熒光強度低于其余2組(均P<0.05)，而B組與C組之間的細胞溶酶體熒光強度差異無統(tǒng)計學意義。

免疫組化染色方法原位檢測樹鼩肝內枯否細胞溶菌酶的變化，光鏡下見溶菌酶陽性細胞主要分布于肝竇內，呈橢圓形、梭形、多角形或星形。陽性染色定位于胞漿，呈顆粒狀棕黃色。A組溶菌酶陽性細胞計數(shù)顯著少于B、C組(均P<0.05)，而B組與C組之間溶菌酶陽性細胞計數(shù)差異無統(tǒng)計學意義，見圖2及表3。

3 枯否細胞TNF-α mRNA表達水平

實時熒光定量RT-PCR檢測結果顯示A組樹鼩枯否細胞的TNF-α mRNA表達水平顯著低于B組和C組(均P<0.05)，而B、C組之間的差異無統(tǒng)計學意義,見圖3。

討 論

枯否細胞是肝固有免疫系統(tǒng)中的重要的一員，但其在HBV感染及病程慢性發(fā)展的過程中究竟扮演著怎樣的角色迄今尚不十分清楚。為此，本研究檢測了慢性感染HBV的樹鼩肝組織內枯否細胞數(shù)量及功能的變化，結果顯示持續(xù)感染HBV的A組動物肝組織中CD163陽性細胞(枯否細胞)的比例和數(shù)量均明顯高于其余兩組動物，這種現(xiàn)象與人類慢性感染HBV患者肝內枯否細胞的改變相類似[11]。提示慢性期特別是機體清除病毒失敗后，HBV大量復制，隨即啟動以適應性免疫應答為主的各種反應，所產生的炎性產物可通過激活枯否細胞導致慢性感染HBV的樹鼩肝組織內枯否細胞逐漸增多[12]。

枯否細胞作為大吞噬細胞，吞噬作用是其清除病原體的重要途徑。溶菌酶是枯否細胞溶酶體水解酶中重要的一員，可反映枯否細胞的吞噬及免疫能力[13]。乙型肝炎病毒感染后，由于肝臟清除及屏蔽功能的削弱，腸源性內毒素滅活不全，常導致不同程度的內毒素血癥。小劑量、短時間的內毒素作用可增強體外培養(yǎng)枯否細胞的吞噬作用，而劑量過大，時間過長反而抑制其吞噬功能[14]。本研究中A組動物的標記枯否細胞溶酶體探針的紅色熒光強度顯著低于B、C組，與溶菌酶的表達水平一致，表明在慢性感染HBV的A組樹鼩肝組織內，枯否細胞內的溶酶體數(shù)量及溶菌酶表達量均減少，即提示枯否細胞的吞噬功能下降。有趣的是，結合本研究關于免疫組化檢測肝組織內CD163+和溶菌酶表達情況的結果發(fā)現(xiàn)，A組CD163+細胞個數(shù)顯著高于B組和C組，但A組溶菌酶陽性細胞個數(shù)則顯著低于B組和C組；A組CD163+細胞個數(shù)遠高于溶菌酶陽性細胞個數(shù)，而B組和C2組的這2個指標的數(shù)值相差不遠。這一現(xiàn)象提示在慢性感染HBV的A組樹鼩中，大部分表達CD163+的枯否細胞不表達溶菌酶，即A組樹鼩肝組織內這些數(shù)量增加的枯否細胞的吞噬能力是下降的。由此推測在慢性感染HBV的個體中，代償性數(shù)量增加但功能下降的枯否細胞無法直接或協(xié)助適應性免疫系統(tǒng)清除入侵的病毒或被感染的肝細胞，從而導致HBV復制失控、病情遷延發(fā)展。

Figure 2. Lysosome count (LysoTracker Red staining; upper) and lysozyme expression (immunohistochemical staining; lower) in Kupffer cells in tree shrew livers (×200). A: group A, identified as persistently infected with HBV; B: group B, suspected as persistently infected with HBV; C: group C, not inoculated with HBV.

表3 樹鼩肝內枯否細胞溶酶體及溶菌酶數(shù)量

Figure 3. TNF-α mRNA expression in tree shrew Kupffer cells tested by real-time RT-PCR. Mean±SD. n=13. *P<0.05 vs other groups.

為評價樹鼩枯否細胞合成炎癥介質的能力，本研究還檢測了枯否細胞TNF-α mRNA的表達情況。有研究證實枯否細胞在TLR 1～9的配體刺激下產生炎性細胞因子TNF-α或IL-6。并且在TLR1、2、4及 6配體的刺激下能誘導T細胞增殖及IFN-γ的合成[15]。轉HBV基因小鼠體內實驗也證實肝內活化的枯否細胞可通過分泌IL-12及TNF-α，來誘導NK細胞及T淋巴細胞產生IFN-γ，從而抑制HBV的復制[16]。而HBV本身又可反過來影響TNF-α的合成[17]。本研究結果顯示，慢性感染HBV的A組樹鼩枯否細胞TNF-α mRNA的表達水平比B組和C組低，這一現(xiàn)象與前述的A組樹鼩枯否細胞吞噬功能下降一致，推測可能是持續(xù)、高載量的HBV導致該組動物肝組織中枯否細胞合成TNF-α減少，而TNF-α mRNA表達的下調則解除了枯否細胞對HBV復制的抑制作用，使該病毒能在肝細胞內大量復制[16]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在樹鼩慢性感染HBV過程中，枯否細胞的數(shù)量及在肝非實質細胞中的比例增加，但該細胞的吞噬功能及合成炎癥介質TNF-α等功能下降，這些變化使HBV得以逃避枯否細胞的免疫效應，從而引起病程慢性化。

[參 考 文 獻]

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