袁 丁， 梁 華， 劉宏霞， 許 婧， 徐 芬， 嚴晉華， 翁建平

(中山大學附屬第三醫(yī)院內分泌與代謝病科，廣東 廣州 510630)

2型糖尿病以胰島素抵抗為特征，而肝臟是胰島素作用的靶器官之一，脂肪在肝臟的異位沉積也是導致外周組織胰島素抵抗的一個重要因素。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，新診斷的2型糖尿病患者分別經胰島素強化治療和口服藥物強化治療后，均能改善β細胞功能及胰島素敏感性，但2種治療方案的血糖控制達標率、達標時間和1年后緩解率不同[1]。這種差異與肝臟脂質沉積改善的分子機制是否相關尚不明確。在高脂飲食和小劑量鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)誘導的SD大鼠2型糖尿病模型當中，早期胰島素和格列齊特治療均能改善糖尿病大鼠肝臟胰島素抵抗[2]，因而我們設想兩者改善大鼠肝臟胰島素抵抗的分子機制可能不盡相同。因此，我們利用胰島素及格列齊特治療高脂飲食和STZ誘導的2型糖尿病大鼠模型，觀察其對肝臟脂質沉積、脂質代謝通路及內質網穩(wěn)態(tài)的影響并探討2種藥物治療的分子機制。

材 料 和 方 法

1 動物模型建立及干預

7～8周齡雄性SD大鼠，體重180～200 g，適應性喂養(yǎng)2周后，根據體重隨機分組，給予普通飼料(脂肪10%)和高脂飼料(脂肪60%，Research Diets)喂養(yǎng)5周。高脂飲食組大鼠腹腔注射1%鏈脲佐菌素(35 mg/kg; Sigma)。鏈脲佐菌素注射后第3天，取尾靜脈血測空腹血糖，空腹血糖>13.8 mmol/L為糖尿病大鼠。將成模的糖尿病大鼠隨機分為：(1) 糖尿病組(diabetes mellitus，DM;n=10)；(2) 早期胰島素治療組(insulin，INS;低精蛋白鋅人胰島素，6～8 U/d，皮下注射;n=10)；(3)格列齊特治療組(gliclazide per os，PO;80 mg·kg-1·d-1，灌胃；n=10)。治療3周結束后3 d處死大鼠，取全血或血清檢測生化指標，取肝臟組織稱量后置液氮，后轉移至-80 ℃冰箱保存。

2 相關指標檢測

空腹血糖用雅培Optium血糖試紙測定，血清甘油三酯(triglyceride, TG)和總膽固醇(total choleste-rol, TC)采用酶法測定。

3 肝臟組織油紅O染色

制作大鼠肝臟組織冰凍切片(厚度0.5 μm)，70%乙醇固定1 min后用蒸餾水漂洗，加入油紅稀釋染液避光密封染色15 min，放入60%乙醇中鏡下分化至間質清晰后用蒸餾水漂洗，再加入Marry蘇木素染核1 min，蒸餾水漂洗后明膠封片，正置顯微鏡(Leica)觀察并攝片，脂肪小滴呈紅色，細胞核呈藍色，間質無色。

4 血清脂聯(lián)素(adiponectin)水平檢測

參照大鼠脂聯(lián)素酶聯(lián)免疫試劑盒(RayBio)說明書，將與辣根過氧化物酶結合的抗生物素蛋白加入96孔板中，加入標準品及受檢大鼠血清樣本進行孵育，與四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)底物溶液顯色后加入硫酸終止反應，用酶標儀在450 nm處檢測。繪制標準曲線得出樣本的脂聯(lián)素濃度。

5 Western blotting

冰浴中勻漿肝臟組織，提取總蛋白(RIPA Lysis and Extraction Buffer，PIERCE)、核蛋白(Merck)，用BCA法測定蛋白濃度，根據蛋白分子量大小分別用7%，10% SDS-PAGE，轉至PVDF膜(Whatman)上。室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h，然后與相應抗體AMPK(AMP-activated protein kinase)、Thr172p-AMPK (AMPK phosphorylated on threonine 172)、Ser372p-SREBP-1c (SREBP-1c phosphorylated on serine 372)、 ACC (acetyl-CoA carboxylase)、 Ser79p-ACC (ACC phosphorylated on serine79)、BiP (immunoglobulin-binding protein)和β-actin(CST)。SREBP-1c (sterol regulatory element-binding protein 1c)抗體(Abcam)4 ℃孵育過夜，次日以TBST洗膜，再用相應熒光Ⅱ抗IRDye 800CW Secondary Antibodies(LI-COR Biosciences)室溫避光孵育1h，洗膜后用Odessey儀器(LI-COR Biosciences)曝光顯影。

6 實時熒光定量PCR

提取大鼠肝臟組織總RNA(Trizol，Invitrogen)，將1 μg總RNA逆轉錄為cDNA(PrimerScript RT reagent Kit，TaKaRa)。使用SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)試劑盒進行擴增，反應體系：cDNA 2 μL，上、下游引物(序列見表1)各0.5 μL，SYBR buffer 10 μL，去離子水7 μL。反應條件：95 ℃預變性 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個循環(huán)。用Ct法(2-ΔΔCt)比較各mRNA表達水平。

表1 引物序列

7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17．0軟件分析，計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組資料比較采用方差分析，兩兩比較采用最小顯著差異(LSD)法。以P<0.05(雙側)為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 各組大鼠的代謝及生化學指標

DM大鼠體重無明顯變化，空腹血糖及血甘油三酯顯著升高。經胰島素及格列齊特治療后，體重有明顯增加，空腹血糖得到改善(P<0.05)，但仍高于NC組(P<0.05)，TG降至NC水平。TC各組間的差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見表2。

表2 SD大鼠生化及代謝指標

2 肝臟脂質沉積情況

DM大鼠肝臟脂滴較NC組明顯增多，胰島素及格列齊特治療后肝臟脂質沉積得到改善，且INS組更為明顯，見圖1。

3 治療對血清Adiponectin及肝臟AdipoR1 mRNA的影響

DM組血清Adiponectin及肝臟AdipoR1 mRNA水平較NC組明顯降低(P<0.05)，分別下降52.0%和48.2%。胰島素治療后均明顯升高(P<0.05)，血清adiponectin較DM組升高了5.3倍，肝臟AdipoR1 mRNA 較DM組升高4.4倍。格列齊特治療后血清adiponectin及肝臟AdipoR1 mRNA水平恢復至NC組水平(均P<0.01)，見圖2。

Figure 1. The hepatic oil red O staining in rats (×200) . NC: normal control; DM: diabetes mellitus; INS: diabetic rats treated with insulin; PO: diabetic rats treated with gliclazide per os.

Figure 2. The levels of serum adiponectin (A) and AdipoR1 mRNA expression (B) in liver.NC:normal control; DM: diabetes mellitus; INS: diabetic rats treated with insulin; PO: diabetic rats treated with gliclazide per os.Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs NC; △△P<0.01 vs DM.

4 治療對Thr172p-AMPK/AMPK表達的影響

DM大鼠AMPK與Thr172p-AMPK均較NC組減少，Thr172p-AMPK/AMPK表達比值(0.25±0.04)較NC(0.67±0.05)下降62.5%(P<0.01)。格列齊特治療后Thr172p-AMPK/AMPK恢復至NC組水平(0.63±0.01)，主要體現(xiàn)在Thr172p-AMPK表達量增加，而總AMPK較DM組無明顯變化。胰島素治療后AMPK與Thr172p-AMPK的表達量均增加，且Thr172p-AMPK的表達較DM組增加顯著，Thr172P-AMPK/AMPK的表達比值(1.23±0.08)較DM組增加了3.87倍，較NC組增加了0.83倍(P<0.01)，見圖3。

Figure 3. Thr172p-AMPK/AMPK protein expression in liver.Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs NC; △△P<0.01 vs DM.

5 治療對Ser372p-SREBP-1c/SREBP-1c表達比值和BiP的影響

與NC組(0.90±0.08)比較，DM大鼠SREBP-1c表達明顯升高，Ser372p-SREBP-1c 水平和Ser372p-SREBP-1c/SREBP-1c比值明顯下降(0.22±0.06)，下降幅度為75.2%(P<0.01)。胰島素治療后，SREBP-1c表達顯著降低，Ser372p-SREBP-1c水平明顯升高，Ser372p-SREBP-1c/SREBP-1c(1.35±0.09)比值較DM組增加5.01倍，較NC組增加了0.49倍(P<0.01)。格列齊特治療后，SREBP-1c表達與DM組相比下降(P<0.01)，但ser372p-SREBP-1c水平明顯升高，其比值恢復至NC組水平(0.90±0.04)。胰島素組SREBP-1c表達水平與格列齊特組相比有顯著差異(P<0.05)，兩治療組Ser372p-SREBP-1c/SREBP-1c差異也有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4A。與NC組(0.42±0.01)比較，DM大鼠BiP蛋白表達明顯增加(0.69±0.01，P<0.01)，胰島素和格列齊特治療后，BiP表達均有所減少，胰島素組BiP表達下降42.9%(P<0.01)，恢復至NC組水平，格列齊特組下降65.6% (P<0.01)，降到NC組水平以下，見圖4B。

6 治療對Ser79p-ACC/ACC表達比值的影響

DM大鼠Ser79p-ACC/ACC表達比值為(0.45±0.02)，較NC組(0.95±0.03)降幅為52.6%(P<0.01)，主要體現(xiàn)在Ser79p-ACC明顯減少。胰島素治療后其比值恢復至NC組水平(0.94±0.02)，而格列齊特治療后無明顯變化(P<0.01)，見圖5。

Figure 4. Ser372p-SREBP-1c/SREBP-1c (A) and BiP (B) protein expression in liver.Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs NC; △△P<0.01 vs DM.

Figure 5. Ser79p-ACC/ACC expression in liver.Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs NC; △△P<0.01 vs DM.

討 論

肝臟是胰島素作用的重要靶器官。肝臟胰島素敏感性下降將促發(fā)肝臟脂質合成，增加甘油三酯含量。我們前期研究顯示短期胰島素或格列齊特強化治療均能改善肝臟胰島素抵抗，但具體分子機制尚不明確[2]。肝臟胰島素抵抗與肝臟過度脂肪堆積密切相關。脂肪酸氧化與合成在維持肝臟脂質平衡中發(fā)揮重要的作用。

脂聯(lián)素是一種脂肪組織特異性分泌的脂肪因子，與胰島素抵抗呈負相關關系，可以通過結合其受體(AdipoR1)激活AMPK從而影響細胞內脂質代謝過程[3]。AMPK是調控肝臟脂質代謝的核心因子，既能通過抑制SREBP-1c的作用減少脂肪酸合成，也能通過磷酸化ACC，從而解除malonyl-CoA對CPT-1的抑制作用增加脂肪酸氧化[4]。因此，AMPK是參與胰島素或格列齊特改善肝臟胰島素抵抗機制的關鍵因子。本研究中，糖尿病組血清脂聯(lián)素水平及其受體adipoR1表達均明顯降低，說明糖尿病組存在胰島素抵抗，而胰島素與格列齊特治療后均能提高脂聯(lián)素及adipoR1表達的水平，激活AMPK，改善胰島素抵抗，此結果與他人報道的結果相似[5-6]。提示2種藥物存在共同的作用機制，但兩者對脂聯(lián)素-AMPK的激活程度不盡相同，提示激活的AMPK的后續(xù)作用和效應，兩者可能存在差異。

SREBP-1c為脂質合成調控的關鍵轉錄因子，AMPK對SREBP-1c的調控現(xiàn)已知有2條途徑，即通過直接磷酸化SREBP-1c絲氨酸372位點抑制SREBP-1c入核[7]及抑制內質網應激間接抑制SREBP-1c表達[8]。在我們的研究中，外源性胰島素激活AMPK既通過磷酸化對SREBP-1c產生短期影響，也通過抑制SREBP-1c的表達產生長期影響。而格列齊特刺激的內源性胰島素對SREBP-1c僅產生磷酸化的短期影響，這可能是胰島素較格列齊特更有利于長期控制血糖、改善胰島素抵抗的機制之一。此外，我們研究發(fā)現(xiàn)，胰島素改善肝臟脂肪沉積的機制還體現(xiàn)在其能通過磷酸化ACC促進脂肪酸氧化，而格列奇特則無此作用，這也是胰島素強化治療為何優(yōu)于格列齊特的原因之一。AMPK尚能通過抑制內質網應激抑制SREBP-1c的激活和表達。既往研究發(fā)現(xiàn)胰島素及格列齊特治療均能改善糖尿病大鼠肝臟的內質網應激，我們的研究也有類似的發(fā)現(xiàn)，但格列齊特組與胰島素組相比BiP的抑制更為明顯，這一點與之前的研究不符[2]。其原因可能是本研究胰島素組的血糖控制與格列齊特組相當，而之前的研究胰島素組的血糖控制比格列齊特組更好所致。

肝臟脂質平衡的機制極其復雜，盡管我們有了一些發(fā)現(xiàn)，但是除了脂聯(lián)素-AMPK通路之外，可能還存在其它機制。瘦素(leptin)也是其中一種脂肪因子，其作用可通過STAT3途徑介導脂肪生成[9]，也能通過JAK2依賴途徑激活AMPK介導脂肪酸氧化[10]。此外，脂聯(lián)素也能通過AdipoR2激活PPARα介導脂肪酸氧化[11]。因此，胰島素和格列齊特改善肝臟脂肪沉積、改善胰島素抵抗的作用機制還有待更多研究去發(fā)現(xiàn)。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)胰島素治療和格列齊特口服藥治療均能通過激活脂聯(lián)素-AMPK減輕2型糖尿病大鼠肝臟的脂質沉積。但兩者具體分子機制有所不同，胰島素激活AMPK，通過抑制SREBP-1c表達、直接磷酸化SREBP-1c抑制SREBP-1c入核等短期和長期的作用以及抑制內質網應激影響SREBP-1c，減少脂質合成；此外，胰島素還通過激活AMPK增加ACC磷酸化增加脂質氧化。而格列齊特僅通過磷酸化的短期作用和抑制內質網應激對SREBP-1c產生影響，且對脂肪酸氧化無作用。兩者機制上的差異可能部分解釋臨床上胰島素較格列齊特更有利于長期控制血糖、改善胰島素抵抗。

[參 考 文 獻]

[1] Weng J, Li Y, Xu W, et al. Effect of intensive insulin therapy on beta-cell function and glycaemic control in patients with newly diagnosed type 2 diabetes: a multicentre randomised parallel-group trial[J]. Lancet, 2008,371(9626):1753-1760.

[2] 孫衛(wèi)平，畢 艷，梁 華，等. 早期胰島素治療對糖尿病大鼠肝臟固醇調節(jié)級聯(lián)反應和脂肪沉積的影響[J]. 中華醫(yī)學雜志,2011,91(26):1809-1812.

[3] Combs TP, Marliss EB. Adiponectin signaling in the liver[J]. Rev Endocr Metab Disord, 2014,15(2):137-147.

[4] Steinberg GR, Kemp BE. AMPK in health and disease[J]. Physiol Rev, 2009,89(3):1025-1078.

[5] Xynogala I, Pepelassi E, Perrea D, et al. Adiponectin and interleukin-6 levels in insulin-treated diabetic rats with experimental periodontitis[J]. Braz Oral Res, 2012,26(1):71-76.

[6] Drzewoski J, Zurawska-Klis M. Effect of gliclazide modified release on adiponectin, interleukin-6, and tumor necrosis factor-alpha plasma levels in individuals with type 2 diabetes mellitus[J]. Curr Med Res Opin, 2006,22(10):1921-1926.

[7] Li Y, Xu S, Mihaylova MM, et al. AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice[J]. Cell Metab, 2011,13(4):376-388.

[8] Tiano JP, Mauvais-Jarvis F. Molecular mechanisms of estrogen receptors’ suppression of lipogenesis in pancreatic beta-cells[J]. Endocrinology, 2012,153(7):2997-3005.

[9] Machinal-Quelin F, Dieudonne MN, Leneveu MC, et al. Proadipogenic effect of leptin on rat preadipocytesinvitro: activation of MAPK and STAT3 signaling pathways[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2002,282(4):C853-C863.

[10] Uotani S, Abe T, Yamaguchi Y. Leptin activates AMP-activated protein kinase in hepatic cells via a JAK2-dependent pathway[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2006,351(1):171-175.

[11] Yamauchi T, Nio Y, Maki T, et al. Targeted disruption of AdipoR1 and AdipoR2 causes abrogation of adiponectin binding and metabolic actions[J]. Nat Med, 2007,13(3):332-339.