李健和，江 愛，陳貴秋，胡 焰，王 瓊，王 霞，邱細(xì)敏

( 1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥學(xué)部，長沙 410011；2.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長沙 410012；3.湖南省疾病預(yù)防控制中心消毒科，長沙 410005)

膚福牌皮膚消毒護(hù)膚噴霧劑是以1%葡萄糖酸氯己定和61%乙醇(w/w)為主藥，并輔以護(hù)膚保濕成分的溶液型噴霧劑，可殺滅腸道致病菌、化膿性球菌、致病性酵母菌和醫(yī)院感染常見細(xì)菌，同時(shí)具有保護(hù)及滋潤皮膚的作用，用于外科手、注射部位皮膚、一般物體表面等的消毒?，F(xiàn)將其研制開發(fā)過程中的安全性評(píng)價(jià)方法與結(jié)果報(bào)道如下, 以期為安全用藥提供依據(jù)。

1 藥物、儀器和動(dòng)物

膚福牌皮膚消毒護(hù)膚噴霧劑(規(guī)格：100 ml/瓶，批號(hào)20120919，中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥學(xué)部)；注射用環(huán)磷酰胺(規(guī)格：0.2 g/支，批號(hào)20120301，山西泰盛制藥有限公司)。AE200電子分析天平(稱量范圍0～200 g，精度0.1 mg，梅特勒-托利多儀器上海有限公司)； Sysmex XT-2000i全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(日本希森美康株式會(huì)社)；Beckman AU680全自動(dòng)生化分析儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)，Leica DM750M金相顯微鏡(德國萊卡公司)。

新西蘭兔，體重2.1～2.5 kg，飼養(yǎng)在普通環(huán)境下，溫度 22～25 ℃，濕度52%～56%。 SPF級(jí)雌、雄性SD大鼠，體重 140～160 g；SPF級(jí)昆明種雌、雄性小鼠，體重18～30 g，飼養(yǎng)在屏蔽環(huán)境，溫度22～24 ℃，濕度52%～56%。上述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2009-0012。

2 方法和結(jié)果

依據(jù)衛(wèi)生部2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》的要求，用膚福牌皮膚消毒護(hù)膚噴霧劑進(jìn)行急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)，多次完整皮膚和一次破損皮膚刺激實(shí)驗(yàn)、急性眼刺激實(shí)驗(yàn)、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)以及亞急性毒性實(shí)驗(yàn)。

2.1 急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn) 20只SPF級(jí)昆明種小鼠，雌雄各半，體重：雌鼠(20.02±1.15) g，雄鼠(20.57±1.02) g。采用一次最大限度實(shí)驗(yàn)，劑量為5000 mg/kg。實(shí)驗(yàn)時(shí)稱取樣品12.50 g，加蒸餾水定容至50 ml，混勻，按20 ml/kg給小鼠一次性經(jīng)口灌胃。灌胃前禁食16 h，灌胃后連續(xù)觀察14 d，記錄中毒表現(xiàn)及死亡情況：灌胃后小鼠無明顯中毒表現(xiàn)，觀察14 d無死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，處死全部小鼠進(jìn)行大體解剖，肝、腎、脾、胃、腸、心、肺等主要臟器未見肉眼可見的異常改變。在本實(shí)驗(yàn)條件下，受試藥品對(duì)昆明種雌、雄小鼠的急性經(jīng)口LD50均>5000 mg/kg，屬實(shí)際無毒級(jí)。

2.2 刺激實(shí)驗(yàn)

2.2.1 多次完整皮膚刺激實(shí)驗(yàn) 取健康白色雌性新西蘭兔3只，體重(2.35±0.11) kg。將樣品0.5 ml直接涂抹于一側(cè)2.5 cm×2.5 cm大小的去毛皮膚上，另一側(cè)去毛皮膚作為空白對(duì)照。涂抹4 h后，用蒸餾水清除殘留受試物。每天涂抹1次，連續(xù)涂抹14 d。在每次涂抹后24 h觀察結(jié)果并進(jìn)行皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分和刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，涂抹受試品側(cè)皮膚和空白對(duì)照側(cè)皮膚紅斑、水腫的評(píng)分均為0分，14 d的總積分均值以及平均每天每只家兔積分均值也均為0分，表明本品對(duì)家兔的多次皮膚刺激強(qiáng)度為無刺激性。

2.2.2 一次破損皮膚刺激實(shí)驗(yàn) 取健康白色雌性新西蘭兔3只，體重(2.32±0.13)kg。將樣品0.5 ml直接涂抹于一側(cè)破損皮膚區(qū)，然后用一層無刺激油紙覆蓋，再用無刺激膠布固定。另一側(cè)去毛破損皮膚用等量滅菌生理鹽水作為對(duì)照，與前作同樣處理。敷用4 h后，用蒸餾水除去殘留受試物，分別于去除受試物后1、24、48 h，觀察皮膚局部反應(yīng)并進(jìn)行刺激反應(yīng)評(píng)分和刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，除一只兔樣品側(cè)1 h水腫的評(píng)分為1分外，其余1、24、48 h樣品側(cè)與對(duì)照側(cè)紅斑、水腫的評(píng)分均為0分，觀察各時(shí)間點(diǎn)受試物對(duì)家兔的一次破損皮膚刺激反應(yīng)的最高積分均值為0.33分，表明本品對(duì)家兔的一次破損皮膚刺激強(qiáng)度為無刺激性。

2.2.3 急性眼刺激實(shí)驗(yàn) 取健康白色雌性新西蘭兔3只，體重(2.30±0.15) kg。吸取受試品原液0.1 ml，滴入家兔一側(cè)眼結(jié)膜囊內(nèi)，另一側(cè)眼以滅菌生理鹽水作為對(duì)照。滴受試物后，將眼被動(dòng)閉合4 s，30 s后用滅菌生理鹽水沖洗。于滴眼后1、24、48、72 h，7、14和21 d肉眼觀察家兔眼結(jié)膜、虹膜和角膜的損傷與恢復(fù)情況，記錄眼刺激反應(yīng)評(píng)分，按眼刺激反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判定受試物對(duì)眼睛的刺激程度。結(jié)果顯示，滴受試物后1 h，3只家兔用藥側(cè)眼結(jié)膜血管充血呈鮮紅色，2只家兔結(jié)膜輕微水腫，1只家兔明顯水腫，伴有部分眼瞼外翻，角膜、虹膜無損傷。用藥后24 h，2只家兔結(jié)膜充血評(píng)分均為1分，2只家兔結(jié)膜水腫評(píng)分均為1分，1只家兔結(jié)膜水腫評(píng)分為2分。用藥后48 h，2只家兔結(jié)膜水腫評(píng)分均為1分。用藥后72 h內(nèi)眼刺激反應(yīng)完全消失，故觀察7 d終止實(shí)驗(yàn)。對(duì)照側(cè)在上述不同觀察時(shí)點(diǎn)均未見角膜與虹膜損害、結(jié)膜充血和結(jié)膜水腫。在本實(shí)驗(yàn)條件下，受試物對(duì)3只家兔的急性眼刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果平均評(píng)分為：角膜損害=0，虹膜損害=0，結(jié)膜充血=0.67，結(jié)膜水腫=2，表明本品對(duì)家兔急性眼刺激實(shí)驗(yàn)的刺激強(qiáng)度為無刺激性。

2.3 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn) 取SPF級(jí)昆明種小鼠雌雄各25只，體重：雌鼠(27.38±1.02) g，雄鼠(28.13±1.14) g。按體重隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半，采用經(jīng)口灌胃30 h染毒法進(jìn)行動(dòng)物染毒。以40 mg/kg劑量的環(huán)磷酰胺[配制方法：稱取注射用環(huán)磷酰胺1支(0.2 g)，加蒸餾水定容至100 ml，搖勻]為陽性對(duì)照，蒸餾水為陰性對(duì)照。受試物3個(gè)劑量分別為5000、2000、500 mg/kg。分別稱取膚福牌皮膚消毒護(hù)膚噴霧劑25.00、10.00、2.50 g加蒸餾水定容至100 ml。給小鼠灌胃2次，每次間隔24 h，灌胃體積為20 ml/kg。末次給樣后6 h頸椎脫臼處死小鼠，取胸骨骨髓用小牛血清稀釋涂片，甲醇固定，Giemsa染色。在光學(xué)顯微鏡下，每只小鼠計(jì)數(shù)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，觀察含有微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)，計(jì)算微核率(以千分率計(jì))；計(jì)數(shù)200個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，計(jì)算嗜多染紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞的比例(PCE/NCE)。采用SPSS 11.0軟件統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果各劑量受試品組微核率與陰性對(duì)照組比較差異無顯著性，而環(huán)磷酰胺組與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)極顯著性意義(P<0.01)。各組PCE/NCE比值均在正常范圍內(nèi)。在本實(shí)驗(yàn)室條件下，受試品對(duì)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。

2.4 亞急性毒性實(shí)驗(yàn) 取SPF級(jí)雌、雄性SD大鼠各20只，體重：雌鼠(149.73±3.82) g，雄鼠(152.88±3.46)g,隨機(jī)分為4組，即對(duì)照組及1000、250、63 mg/kg 3個(gè)受試品組，每組10只，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)時(shí)分別稱取樣品20.00、5.00、1.26 g加蒸餾水定容至200 ml，分別給受試大鼠灌胃，對(duì)照組予以等體積的蒸餾水，每天1次，灌胃體積為10 ml/kg，連續(xù)28 d。各組大鼠均喂以普通飼料，自由攝食和飲水。每天觀察大鼠的活動(dòng)表現(xiàn)及中毒癥狀，每周稱一次體重。實(shí)驗(yàn)?zāi)┢冢?6 h采血，禁食前和禁食后/采血前稱量大鼠體重。采血時(shí)，每只大鼠摘眼球采集兩份血，抗凝管全血進(jìn)行血液學(xué)檢查，非抗凝管血分離血清后進(jìn)行血液生化檢查。頸椎脫臼處死大鼠作大體解剖檢查，稱肝、腎、脾、心、腦、肺、睪丸/卵巢重量，計(jì)算臟器/體重比值，取心、肝、脾、肺、腎、胃、十二指腸、睪丸/卵巢、腦、腎上腺作病理切片檢查。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，多組定量數(shù)據(jù)用ANOVA+SNK進(jìn)行比較。

結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠未見明顯異常行為和中毒癥狀，無死亡；各劑量組大鼠體重、增重與對(duì)照組比較無顯著性差異(P>0.05)。受試品對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響見表1，各劑量組雌、雄大鼠的血紅蛋白、紅細(xì)胞總數(shù)、血細(xì)胞比容、血小板總數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類與對(duì)照組比較，均無顯著性差異(P>0.05)。

受試品對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)的影響見表2，連續(xù)給藥28 d,各劑量組雌、雄大鼠的血液生化指標(biāo)與對(duì)照組比較，無顯著性差異(P>0.05)。

各劑量組受試品對(duì)大鼠禁食后體重，以及肝、腎、脾、心、腦、肺、睪丸、卵巢重量及其與體重的比值與對(duì)照組比較，無顯著性差異(P>0.05)。

各劑量組大鼠尸體解剖時(shí)，肉眼檢查未發(fā)現(xiàn)明顯病變。鏡下檢查結(jié)果如下。肝臟：被膜完整，肝小葉結(jié)構(gòu)清楚；其中對(duì)照組1只雄鼠肝細(xì)胞見點(diǎn)狀壞死。腎臟：被膜完整，腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常；其中對(duì)照組1只雌鼠，高劑量組1只雄鼠腎間質(zhì)見少量炎性細(xì)胞浸潤。胃腸：各層結(jié)構(gòu)清楚，黏膜上層完整，黏膜下層未見異常。脾臟：被膜完整，脾小梁結(jié)構(gòu)正常，紅白髓比例正常。睪丸：曲精管內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞發(fā)育良好，間質(zhì)未見異常。卵巢：上皮與白膜正常，各級(jí)卵泡發(fā)育良好，未見異常。肺：肺泡無擴(kuò)展融合、塌陷，其中低劑量組1只雌鼠、對(duì)照組1只雄鼠、中劑量組1只雄鼠見輕度支氣管肺炎。心臟：心肌纖維正常，無變形壞死，心間質(zhì)未見異常。腦：腦膜正常，神經(jīng)元和腦膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，無變形壞死，無肥大增生。腎上腺：皮質(zhì)的球狀帶、束狀帶及網(wǎng)狀帶細(xì)胞正常，髓質(zhì)細(xì)胞及中央靜脈未見異常。

表1 受試品對(duì)亞急性毒性實(shí)驗(yàn)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

Table 1 Effects of test substances on hematologic indexes in subacute toxicity test in rats

表1 受試品對(duì)亞急性毒性實(shí)驗(yàn)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

性別組別劑量(mg/kg)血紅蛋白(ρB/g·L-1)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(×1012/L)血細(xì)胞比容血小板計(jì)數(shù)(×109/L)白細(xì)胞計(jì)數(shù)(×109/L)白細(xì)胞分類(%)淋巴細(xì)胞中性粒細(xì)胞單核細(xì)胞嗜酸性粒細(xì)胞嗜堿性粒細(xì)胞雄對(duì)照組144±108．44±0．290．46±0．01779±11311．66±0．4372．30±6．0221．28±5．445．00±0．921．18±0．750．02±0．01受試品組63145±58．20±0．340．44±0．03760±22311．94±2．2469．82±3．3622．28±3．056．62±1．820．86±1．040．03±0．02受試品組250144±108．48±0．270．46±0．03611±19012．05±1．3872．64±4．9520．18±4．105．86±0．791．12±1．130．02±0．01受試品組1000144±88．53±0．340．47±0．02659±7712．66±2．7372．24±8．8420．36±7．306．48±2．100．72±0．830．02±0．01雌對(duì)照組149±47．99±0．540．44±0．03749±18611．48±1．4771．56±7．0820．76±8．186．08±1．351．28±0．940．03±0．01受試品組63143±78．44±0．330．45±0．02706±10212．51±1．7171．48±4．5820．02±3．707．30±1．260．94±0．920．03±0．00受試品組250149±88．10±0．490．44±0．03751±15411．53±2．8570．66±6．6020．66±7．467．24±2．091．24±0．760．02±0．01受試品組1000148±27．86±0．310．44±0．01852±12013．67±3．7371．76±5．0320．78±6．446．20±0．971．08±0．800．02±0．01

表2 受試品對(duì)亞急性毒性實(shí)驗(yàn)大鼠血液生化指標(biāo)的影響

Table 2 Effects of test substances on biochemical indexes in subacute toxicity test in rats

表2 受試品對(duì)亞急性毒性實(shí)驗(yàn)大鼠血液生化指標(biāo)的影響

性別組別劑量(mg/kg)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(zB/U·L-1)天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(zB/U·L-1)總蛋白(ρB/g·L-1)白蛋白(ρB/g·L-1)膽固醇(cB/mmol·L-1)三酰甘油(cB/mmol·L-1)血尿素氮(cB/mmol·L-1)血肌酐(cB/μmol·L-1)血糖(cB/mmol·L-1)雄對(duì)照組49．66±11．20163．05±38．9468．30±3．6732．48±0．861．90±0．430．95±0．276．14±0．9458．74±6．745．18±0．31受試品組6345．32±8．18141．76±26．7066．85±1．8032．65±0．222．29±0．330．90±0．375．45±0．4259．12±2．665．48±0．66受試品組25046．58±6．68150．14±30．9565．89±4．1832．16±0．972．12±0．411．04±0．215．12±1．2756．21±3．574．91±0．37受試品組100047．10±6．90155．46±11．2467．13±0．9032．27±0．732．26±0．480．98±0．276．35±0．8659．49±1．445．49±0．14雌對(duì)照組55．16±7．39157．33±11．5965．61±3．8232．02±0．272．16±0．270．90±0．315．69±1．0357．47±2．005．04±0．31受試品組6348．92±4．59154．77±35．4064．76±3．6931．91±1．122．05±0．430．95±0．406．67±1．1058．23±3．426．10±1．22受試品組25054．40±9．80168．85±9．6863．14±0．6531．76±0．542．11±0．530．86±0．666．11±0．2856．46±4．325．65±1．06受試品組100048．72±7．90132．61±20．8064．89±2．0832．40±0．382．19±0．480．91±0．455．21±0．9257．98±2．115．99±0．27

綜上所述，以1000、250、63 mg/kg劑量的受試品給大鼠經(jīng)口灌胃28 d，各劑量組大鼠體重、臟器重量及臟器/體重比值與對(duì)照組比較無顯著性差異(P>0.05)。各劑量受試品對(duì)大鼠的血液學(xué)、血液生化各項(xiàng)指標(biāo)未見明顯影響。大鼠作大體解剖，未發(fā)現(xiàn)明顯病變。病理切片檢查結(jié)果未見與受試品有關(guān)的病理改變。提示亞急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)該受試品對(duì)雌、雄SD大鼠未觀察到有害作用的最大劑量為1000 mg/kg。

3 討 論

2001年6月美國FDA批準(zhǔn)了由3M Health Care Inc藥廠研制開發(fā)的一種以1%葡萄糖酸氯己定和61%乙醇(w/w)為主藥，并輔以護(hù)膚成分的溶液型洗手劑，商品名Avagard,用于外科醫(yī)師洗手、消毒以及醫(yī)務(wù)人員洗手[1]。據(jù)此，作者也立項(xiàng)研制開發(fā)以1%葡萄糖酸氯己定和61%乙醇(w/w)為主藥，并輔以護(hù)膚、保濕成分的木糖醇的溶液型皮膚消毒液。

葡萄糖酸氯己定是外用廣譜抗菌劑及陽離子表面活性劑，與皮膚有良好親和性，吸附并殘留在皮膚表面，具有長效抗菌性能，與乙醇復(fù)配，可起到協(xié)同作用，增強(qiáng)殺菌效果，提高殺菌速度，高乙醇含量將微生物迅速浸濕穿透，提供了快速殺菌的先決條件[1-3]。由于含醇類，可在手清潔干燥的基礎(chǔ)上直接進(jìn)行擦拭消毒，操作更為簡(jiǎn)便，皮膚干燥速度快，減少了臨床操作程序。此消毒液乙醇含量為61%，比常用濃度70%有所降低，增加了水溶液含量，使用方便(用后不用水洗)，可避免因長期使用而出現(xiàn)皮膚干裂、粗糙的問題。

長期頻繁地使用肥皂洗手、消毒液浸泡的醫(yī)護(hù)人員, 尤其是在干燥寒冷的冬季,手部皮膚長時(shí)間處于堿性狀態(tài)下, 阻礙皮膚油脂層的恢復(fù)；破壞角蛋白的結(jié)構(gòu),使皮膚失去彈性,表現(xiàn)為皮膚干燥、粗糙,發(fā)生皸裂。在本研究中，作者采用有護(hù)膚、保濕作用的木糖醇來解決此問題。木糖醇是一種五碳糖醇，有護(hù)膚、保濕作用[4]。本品在殺滅腸道致病菌、化膿性球菌、致病性酵母菌和醫(yī)院感染常見細(xì)菌的同時(shí)，還具有保護(hù)及滋潤皮膚的作用。其殺菌效率高，且具長效抗菌性能；消毒過程一次性完成，方便省時(shí)；適用價(jià)值高，使用范圍廣；性能穩(wěn)定，無毒，無刺激性，安全可靠。本消毒液配方科學(xué), 制備工藝簡(jiǎn)單, 使用方便。本品的研制成功，將帶來良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

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