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        LC-MS-MS法測(cè)定人血漿中非布司他濃度

        2014-08-06 06:52:56楊永革宋麗雪許雪廷北京軍區(qū)總醫(yī)院藥理科北京100700
        藥學(xué)實(shí)踐雜志 2014年5期
        關(guān)鍵詞:布司貝特內(nèi)標(biāo)

        姜 楠,楊永革,宋麗雪,許雪廷 (北京軍區(qū)總醫(yī)院藥理科,北京 100700)

        非布司他 (febuxostat,F(xiàn)EB) 是新型的非嘌類(lèi)黃嘌呤氧化酶選擇性抑制劑[1],臨床上用于預(yù)防和治療高尿酸血癥及引發(fā)的痛風(fēng)。其化學(xué)名稱(chēng)為(3-氰基-4-異丁氧基苯基) -4-甲基 -5-唑甲酸,是美國(guó) FDA于 2009 年 2 月 13 日批準(zhǔn)的用于治療尿酸過(guò)高癥的藥物,至今國(guó)內(nèi)仍未上市。到目前為止,關(guān)于非布司他的研究報(bào)道較少。為了更清楚了解非布司他的藥學(xué)特點(diǎn),本研究建立了簡(jiǎn)單、靈敏的LC-MS-MS檢測(cè)人血漿非布司他濃度的方法,適用于非布司他人體藥代動(dòng)力學(xué)和生物等效性研究。

        1 儀器與試劑

        1.1儀器 質(zhì)譜儀:Thermo Finnigan TSQ Quantum型液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀,配有電噴霧離子化源(ESI源);Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng): G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器;G1312A二元梯度泵;在線脫氣機(jī)、柱溫箱(美國(guó)Agilent公司)、分析柱為T(mén)hermo Biobasic-8柱(5 μm,50 mm×2.1 mm);FinniganXcalibur 色譜/質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)。Sigma1-14型高速離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司);XW-80A微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器有限公司);Ohaus Discovery型電子分析天平(奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司)。

        1.2試劑 非布司他對(duì)照品(南京海辰藥業(yè)有限公司,純度99.5%,批號(hào):20100401),內(nèi)標(biāo)苯扎貝特對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào):100732-200501)。乙腈、甲醇為色譜純(均為Merck公司);乙酸胺、甲酸為分析純,水為重蒸去離子水。

        2 方法與結(jié)果

        2.1試驗(yàn)條件

        2.1.1色譜條件 色譜柱:Thermo Biobasic-8柱(5 μm,50 mm×2.1 mm),流動(dòng)相:乙腈-10 mmol/L乙酸銨(含0.05%甲酸)(70:30),流速:0.2 ml/min;柱溫:室溫。

        2.1.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子化電離源ESI負(fù)離子檢測(cè),噴霧電壓(SP)3 500 kV,鞘氣(SGP)流速10 Arb,輔助氣(AGP)流速45 Arb,毛細(xì)管溫度(TEM 270 ℃;非布司他和內(nèi)標(biāo)苯扎貝特的碰撞能量分別為10、18 eV;選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)分別測(cè)定非布司他和內(nèi)標(biāo)苯扎貝特負(fù)離子m/z315→271和m/z360→274;掃描時(shí)間為0.5 s。

        2.2血漿樣本的預(yù)處理 精密量取血漿樣品100 μl,置1.5 ml具塞小塑料管中,加10 μl內(nèi)標(biāo)溶液(苯扎貝特,50 μg/ml)混勻,再加300 μl 乙腈→在微型混合器上渦流振蕩2 min(沉淀蛋白)→離心(10 000 r/min)10 min分層,取上清夜100 μl放入進(jìn)樣瓶中,10 μl進(jìn)樣檢測(cè)。

        2.3方法的專(zhuān)屬性 按選定的LC-MS-MS條件測(cè)試6名健康人的空白血漿、空白血漿+非布司他標(biāo)準(zhǔn)樣品+內(nèi)標(biāo)、受試者口服非布司他片后的血漿樣品,來(lái)對(duì)特異性進(jìn)行考察。由圖1可見(jiàn)非布司他與苯扎貝特分別在1.14和1.00 min出峰(圖中從左至右分別為總離子流圖、非布司他、苯扎貝特),非布司他與苯扎貝特峰形良好,無(wú)雜質(zhì)峰干擾測(cè)定,專(zhuān)屬性好。

        圖1 血漿中非布司他選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)色譜圖

        2.4線性范圍和定量限 精稱(chēng)10.05 mg非布司他對(duì)照品(相當(dāng)于非布司他10 mg)、10 mg苯扎貝特標(biāo)準(zhǔn)品,分別溶于10 ml甲醇成1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,分裝后-70 ℃儲(chǔ)存待用。用1 g/L非布司他標(biāo)準(zhǔn)品溶液配成一系列濃度的工作溶液,分別取各濃度工作溶液10μl于90μl空白血漿中,使非布司他的血漿終濃度分別為10、30、100、300、1 000、3 000、6 000、8 000 μg/L,余同血漿樣品處理和測(cè)定。將不同濃度系列標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)得的非布司他與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo),非布司他濃度為橫坐標(biāo),直線加權(quán)回歸。得到線性回歸方程Y=0.003 094+0.000 756X,r>0.99。方法的最低檢測(cè)濃度為10 μg/L。

        2.5精密度與回收率 按非布司他標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法制備質(zhì)控樣品,對(duì)30、1 000、7 000 μg/L 3種濃度進(jìn)行了連續(xù)3 d的6個(gè)樣本分析,以評(píng)價(jià)方法的日內(nèi)、日間精密度。以空白血漿乙腈沉淀提取液,加入非布司他與內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制低、中、高3種濃度(30、1 000、7 000 μg/L)的標(biāo)準(zhǔn)品樣本,計(jì)算回收率。以流動(dòng)相代替空白血漿,同樣方法配制低、中、高3種濃度(30、1 000、7 000 μg/L)的標(biāo)準(zhǔn)品樣本,計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。方法學(xué)考察結(jié)果見(jiàn)表1。

        表1 方法學(xué)考察結(jié)果

        2.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 對(duì)室溫放置2 h、-70℃保存30 d、-70℃-室溫反復(fù)凍融3次的血漿樣品穩(wěn)定性進(jìn)行考察,低、中、高3個(gè)濃度變異均小于15%,符合指導(dǎo)原則要求;血漿樣本經(jīng)2.2項(xiàng)下預(yù)處理后室溫放置8 h可保持穩(wěn)定。

        3 討論

        非布司他是美國(guó) FDA于 2009 年批準(zhǔn)的用于治療尿酸過(guò)高癥的藥物,至今國(guó)內(nèi)仍未上市。國(guó)內(nèi)發(fā)表的非布司他血藥濃度檢測(cè)的文獻(xiàn)較少[2,3]。為了更清楚地了解非布司他在中國(guó)人體內(nèi)的藥學(xué)特點(diǎn),筆者建立了簡(jiǎn)單、靈敏的LC-MS-MS檢測(cè)方法,并用于臨床生物樣本的大批量檢測(cè)。

        本方法采用恒比流動(dòng)相質(zhì)譜檢測(cè)法,比熒光梯度檢測(cè)法[2]快捷靈敏;并通過(guò)優(yōu)化色譜條件,選擇了Thermo Biobasic-8柱(5 μm,50 mm×2.1 mm),使單個(gè)樣品檢測(cè)僅需要2 min,比文獻(xiàn)[3]大大減少了檢測(cè)時(shí)間與環(huán)境污染;采用乙腈沉淀法,使血漿樣品處理非常簡(jiǎn)便快捷。

        本方法檢測(cè)專(zhuān)屬性強(qiáng),靈敏度高,簡(jiǎn)便快捷,適于臨床生物樣本的大批量檢測(cè),對(duì)非布司他生物等效性與藥代動(dòng)力學(xué)研究有很好的參考價(jià)值。

        【參考文獻(xiàn)】

        [1] Mayer MD, Khosravan R, Vernillet L,etal. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of febuxostal, a new non-purine selective inhibitor of xanthine oxidase, in subjects with renal impairment[J]. Am J Ther, 2005,12(1):22-34.

        [2] 張文麗,程 航,陽(yáng)國(guó)平.高效液相-熒光法測(cè)定人血漿中非布司他的濃度及其人體藥動(dòng)學(xué)研究[J].臨床藥理學(xué),2011,16(10):1148-1152.

        [3] 施 政,劉 健,申屠建中,等. 非布司他在中國(guó)健康人體的生物等效性[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志,2013,162(4):276-279.

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