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        麝香保心丸促進(jìn)血管新生作用的活性成分篩選

        2014-08-06 06:52:56黃慧梅暢婉琳柳潤輝福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院福建福州350108
        藥學(xué)實(shí)踐雜志 2014年5期
        關(guān)鍵詞:麝香皂苷內(nèi)皮細(xì)胞

        呂 超,黃慧梅,暢婉琳,柳潤輝 (福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,福建 福州 350108)

        血管新生過程主要涉及到基底膜降解、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及管腔結(jié)構(gòu)形成等步驟,這些過程受到一些生長因子的嚴(yán)密控制,當(dāng)調(diào)節(jié)失衡會(huì)導(dǎo)致機(jī)體處于病理狀態(tài),如缺血性疾病、腫瘤等[1]。目前,缺血性疾病是威脅人類健康的嚴(yán)重疾病之一,這類疾病的治療與血管新生密不可分。

        麝香保心丸(Shexiang Baoxin pill, SBP)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有促進(jìn)血管新生作用的中成藥,它能夠治療由心肌缺血導(dǎo)致的心絞痛、胸悶等心臟疾病[2],主要由人參、麝香、肉桂、冰片、蟾酥、蘇合香、牛黃七味中藥配伍組成。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,麝香保心丸不僅能夠保護(hù)血管內(nèi)皮、抑制動(dòng)脈粥樣硬化、減少梗死面積,還能促進(jìn)心肌缺血區(qū)域的血管新生,建立側(cè)枝循環(huán),實(shí)現(xiàn)藥物性心臟“自身搭橋”,全面改善心臟功能[3-6]。目前,已有研究證實(shí)麝香保心丸具有促血管新生作用[7],但主要的有效活性成分尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)體外培養(yǎng)體系對(duì)麝香保心丸及其20種單體入血進(jìn)行血管新生活性成分的篩選,明確藥效物質(zhì),并對(duì)其在體外促進(jìn)血管新生作用進(jìn)行研究。

        1 材料

        1.1動(dòng)物 SD大鼠[上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,許可證號(hào):SCXK(滬)2012-0002],雄性,體重180~200 g。動(dòng)物飼養(yǎng)于第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院動(dòng)物房,適應(yīng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

        1.2藥物準(zhǔn)備 麝香保心丸由上海和黃藥業(yè)有限公司提供。將麝香保心丸研磨成粉末,制成浸膏,精密稱取1.5 mg,用1.5 ml含1% FBS的MCDB131基礎(chǔ)培養(yǎng)基完全溶解,配制成1 mg/ml的母液,然后按比例稀釋成10-4、10-3、10-2μg/ml的工作液(麝香保心丸含有揮發(fā)性成分,最好現(xiàn)用現(xiàn)配)。各單體化合物人參皂苷Rg1、Rb1、Rb2、Rc、Re、Rd、Rg3、Rh2、肉桂醛、肉桂酸、去氧膽酸、膽酸、鵝去氧膽酸、熊去氧膽酸、豬去氧膽酸、麝香酮、蟾毒靈、華蟾酥毒基、日蟾毒它靈、酯蟾毒配和龍腦由中國藥品生物制品檢定所提供,純度為98%以上。精密稱取各單體化合物,用DMSO完全溶解,制成10 mmol/L的母液,用時(shí)用含1% FBS的MCDB131基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋成1、5、10 μmol/L的工作液(其中麝香酮、肉桂醛、龍腦為揮發(fā)性成分,最好現(xiàn)用現(xiàn)配)。

        1.3試劑 MCDB131完全培養(yǎng)基、MCDB131基礎(chǔ)培養(yǎng)基(美國AllCells公司);M199培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(美國Gibico公司);磷酸鹽緩沖液(美國Hyclone公司);細(xì)胞周期檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司);Matrigel基質(zhì)膠(美國Sigma公司)。

        1.4儀器與設(shè)備 實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀(Real-Time Cell Analyzer, RTCA, xCELLigence檢測系統(tǒng),瑞士Roche公司)、細(xì)胞增殖培養(yǎng)板(E-16 Plates,瑞士Roche公司)、細(xì)胞遷移培養(yǎng)板(CIM-16 Plates,瑞士Roche公司);電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司);倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司);二氧化碳培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司);臺(tái)式高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)。

        2 方法

        2.1細(xì)胞培養(yǎng) 原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC,美國ALLCELLs公司)采用MCDB131完全培養(yǎng)基培養(yǎng)(內(nèi)含10% FBS 、5 U/ml肝素和30 ml內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑),于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞達(dá)到80%融合度后以1:4的比例傳代。

        2.2細(xì)胞增殖與細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

        2.2.1xCELLigence系統(tǒng) 系統(tǒng)主要由分析檢測器、裝置工作站和放置細(xì)胞培養(yǎng)板的微電極平臺(tái)三部分組成。,其主要通過檢測細(xì)胞的阻抗值并計(jì)算細(xì)胞指數(shù)(cell index,CI)來衡量細(xì)胞數(shù)的多少。CI計(jì)算公式:

        (Zi是實(shí)驗(yàn)過程中每次檢測細(xì)胞時(shí)的電阻,Z0是開始檢測的基準(zhǔn)電阻)。

        2.2.2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 采用含有微陣列檢測電極的細(xì)胞增殖培養(yǎng)板E-16 Plates(16孔板)培養(yǎng)細(xì)胞(圖1)。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞,每孔加入100 μl細(xì)胞懸液(3×104個(gè)/ml),接種到培養(yǎng)板,室溫放置30 min,將培養(yǎng)板置于微電極平臺(tái),開始動(dòng)態(tài)檢測,待細(xì)胞貼壁良好以后,將細(xì)胞培養(yǎng)液換成含1% FBS和不同濃度藥物的MCDB131基礎(chǔ)培養(yǎng)基,繼續(xù)動(dòng)態(tài)檢測,以獲得藥效達(dá)到最佳的作用時(shí)間,根據(jù)CI值繪制曲線(分組:10-4、10-3、10-2μg/ml SBP組;1、5、10 μmol/L各單體化合物組;對(duì)照組為含等量DMSO的不含藥培養(yǎng)基)。

        圖1 細(xì)胞增殖培養(yǎng)板E-16 Plates

        2.2.3細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 采用細(xì)胞遷移培養(yǎng)板CIM-16 Plates(16孔板)培養(yǎng)細(xì)胞,每個(gè)培養(yǎng)板由上室板和下室板兩部分組成,由上室板底部的8 μm孔徑大小的半滲透薄膜隔開,膜下包被微陣列檢測電極(圖2)。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞,用MCDB131基礎(chǔ)培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液(2×105個(gè)/ml),加藥孵育,室溫,30 min(分組:10-4、10-3、10-2μg/ml SBP組;1、5、10 μmol/L具有增殖作用單體化合物組;對(duì)照組為含等量DMSO的不含藥培養(yǎng)基 )。在下室板中加入相應(yīng)培養(yǎng)液(含有20 ng/ml VEGF和20% FBS的MCDB131基礎(chǔ)培養(yǎng)基,160 μl/孔),將上室板和下室板安裝在一起,在上室板中加入已經(jīng)孵育好的細(xì)胞懸液(100 μl/孔),將培養(yǎng)板置于微電極平臺(tái),開始動(dòng)態(tài)檢測,以獲得藥效達(dá)到最佳的作用時(shí)間,根據(jù)CI值繪制曲線。

        圖2 細(xì)胞遷移培養(yǎng)板CIM-16 Plates

        2.3體外成管實(shí)驗(yàn) 在96孔中加入基質(zhì)膠(matrigel)50 μl/孔,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中30 min,待膠凝固后使用。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞,用含1% FBS的MCDB131基礎(chǔ)培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液(5×105個(gè)/ml),加入預(yù)包被的96孔板中(100 μl/孔),加藥孵育4 h后,在40倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)(分組同2.2.3)。

        2.4主動(dòng)脈環(huán)體外成管實(shí)驗(yàn) 取180~200 g SD大鼠,10%水合氯醛麻醉,用75%乙醇將體表消毒,轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)內(nèi),將大鼠胸部沿一側(cè)剪開,小心剝離結(jié)締組織,切取3 cm長的胸主動(dòng)脈,迅速放入預(yù)冷的PBS(含100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素),反復(fù)清洗,將血管內(nèi)外表面的殘余血細(xì)胞去除干凈,用消毒后的鋒利刀片切取1 mm寬度的動(dòng)脈環(huán),選取大小相似的置于預(yù)冷的M199培養(yǎng)基中備用。在24孔板中加入稀釋好的matrigel膠(400 μl/孔,用不含血清的M199培養(yǎng)基以1:1的比例稀釋),每孔隨機(jī)植入1個(gè)動(dòng)脈環(huán),使其盡量置于孔的中央并緊貼孔底,于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中放置30 min,待膠凝固,每孔加入 200 μl含藥培養(yǎng)基(分組同2.2.3)。隔天換液一次,6 d后在倒置顯微鏡下分別由4名不同觀察者觀察計(jì)數(shù),根據(jù)內(nèi)皮細(xì)胞出芽情況,評(píng)價(jià)動(dòng)脈環(huán)血管新生[8](以0~5分范圍作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),0分:內(nèi)皮細(xì)胞無芽生,5分:內(nèi)皮細(xì)胞大量芽生)。

        3 結(jié)果

        3.1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) xCELLigence檢測SBP和各單體入血成分對(duì)HUVECs增殖的影響。結(jié)果如圖3所示,CI值呈時(shí)間依賴性增加;與對(duì)照組相比,SBP與HUVECs共孵育24 h,在10-4、10-3、10-2μg/ml濃度下CI值依次增加,說明SBP能夠誘導(dǎo)HUVECs增殖,并且呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴關(guān)系(P<0.05)。在SBP的各單體入血成分中,只有人參皂苷Rg3和Rh2具有較明顯的促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用,二者在1、5、10 μmol/L濃度下均表現(xiàn)出顯著的藥效(P<0.05)。因此,我們將對(duì)不同濃度的SBP(10-4~10-2μg/ml)、Rg3(1~10 μmol/L)和Rh2(1~10 μmol/L)在體外促進(jìn)血管新生活性作用進(jìn)行研究。

        圖3 不同濃度SBP、Rg3及Rh2對(duì)HUVECs增殖的影響,P<0.05,與對(duì)照組比較

        3.2細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) xCELLigence檢測SBP、Rg3和Rh2對(duì)HUVECs遷移的影響。結(jié)果如圖4所示,CI值呈時(shí)間依賴性增加, SBP(10-4、10-3、10-2μg/ml)、Rg3(1、5、10 μmol/L)和Rh2(1、5、10 μmol/L)加藥組的CI值均比對(duì)照組明顯增加,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示,SBP、Rg3和Rh2均能顯著誘導(dǎo)HUVECs遷移。

        圖4 不同濃度SBP、Rg3及Rh2對(duì)HUVECs遷移的影響,P<0.05,與對(duì)照組比較

        3.3體外成管實(shí)驗(yàn) 如圖5所示,與對(duì)照組相比,加入SBP、Rg3和Rh2后,管腔形成數(shù)目明顯增多,小管間距變小并逐漸交織成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。對(duì)管狀分支點(diǎn)計(jì)數(shù)后發(fā)現(xiàn):對(duì)照組分支點(diǎn)數(shù)目為18/視野,SBP組在10-4、10-3、10-2μg/ml濃度下分別為34、41、48/視野,Rg3組在1、5、10 μmol/L濃度下分別為26、32、40/視野,Rh2組在1、5、10 μmol/L濃度下分別為35、36、42/視野,與對(duì)照組相比均有顯著性差異(P<0.01)。結(jié)果顯示,SBP、Rg3和Rh2均能促進(jìn)HUVECs管腔結(jié)構(gòu)形成,并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

        圖5 不同濃度SBP、Rg3及Rh2對(duì)HUVECs管腔形成的影響

        3.4主動(dòng)脈環(huán)體外成管實(shí)驗(yàn) 如圖6所示,在實(shí)驗(yàn)6 d期間,對(duì)照組動(dòng)脈環(huán)僅有很少的內(nèi)皮細(xì)胞芽生,評(píng)分為0.9分;與對(duì)照組相比,加入SBP (10-2μg/ml)、Rg3 (10 μmol/L)和Rh2(5、10 μmol/L)后,內(nèi)皮細(xì)胞出芽顯著增多,分別評(píng)為3.6、3.5、2.1、3.2分(P<0.001),而SBP和Rg3在其他濃度下對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞出芽并無明顯影響(P>0.05)。結(jié)果顯示,SBP、Rg3和Rh2均能促進(jìn)主動(dòng)脈環(huán)體外血管新生,并且在高濃度下效果比較顯著。

        圖6 不同濃度SBP、Rg3及Rh2對(duì)主動(dòng)脈環(huán)血管新生的影響

        4 討論

        麝香保心丸源自于《太平惠民和劑局方》,具有芳香溫通、益氣強(qiáng)心的功效,能夠促進(jìn)缺血心肌血管新生,增加冠脈血流量,從根本上治療冠心病。臨床研究顯示,長期服用SBP能夠有效增加心肌灌注,心肌缺血癥狀得到好轉(zhuǎn),胸悶、心絞痛發(fā)作頻率降低,治療后血管新生在本病治療中也發(fā)揮重要作用[9]。已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),SBP具有促進(jìn)血管新生活性,增加缺血心肌血管密度[4,6]。本研究則通過利用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和大鼠主動(dòng)脈環(huán)體外培養(yǎng)模型對(duì)SBP及其20種單體入血成分進(jìn)行促血管新生活性研究,結(jié)果得出,SBP及單體化合物人參皂苷Rg3、Rh2具有顯著的誘導(dǎo)內(nèi)皮增殖活性。繼而,細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和管腔形成實(shí)驗(yàn)研究表明,SBP、Rg3、Rh2在體外具有促進(jìn)血管新生的活性,并在大鼠主動(dòng)脈環(huán)模型上得到證實(shí)。

        自2004年以來,實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀開始用于監(jiān)測細(xì)胞的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化過程。系統(tǒng)的核心是把微電子細(xì)胞傳感器芯片整合到表面適于細(xì)胞生長的細(xì)胞檢測板的底部或細(xì)胞遷移板的微孔膜,當(dāng)電場加在上

        面的時(shí)候可以測量到一個(gè)基線阻抗,細(xì)胞的有無以及貼壁程度的改變都會(huì)影響電極傳感器表面電子和離子的通過。沒有細(xì)胞時(shí),檢測孔底部排列的微電極陣列的阻抗分布近似均勻;加入細(xì)胞后,細(xì)胞會(huì)和電極表面接觸黏附,影響電極和溶液間的離子環(huán)境,導(dǎo)致阻抗的升高,細(xì)胞越多阻抗增加越多。細(xì)胞在上述表面上的貼壁、生長以及貼壁緊密程度可引起各個(gè)電極陣列的電極結(jié)構(gòu)的阻抗變化,黏附在電極表面的細(xì)胞越多,CI越大。當(dāng)細(xì)胞生物狀態(tài)發(fā)生變化時(shí),系統(tǒng)可以實(shí)時(shí)并自動(dòng)獲取其模擬電信號(hào),并可以轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)(CI)以進(jìn)行進(jìn)一步的分析[10,11]。

        內(nèi)皮細(xì)胞增殖在血管新生過程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用,已有研究表明三七皂苷Ft1具有較好的促進(jìn)細(xì)胞增殖的活性,甚至在10 μmol/L濃度下活性優(yōu)于20 ng/ml VEGF[12]。人參皂苷Rg3和Rh2的結(jié)構(gòu)與Ft1十分相似,都屬于達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜皂苷,本研究通過利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀監(jiān)測人參皂苷Rg3和Rh2處理后的HUVECs的動(dòng)態(tài)變化過程發(fā)現(xiàn),Rg3、Rh2在1、5、10 μmol/L濃度下能夠誘導(dǎo)CI值依次增加,說明Rg3、Rh2可促進(jìn)HUVECs增殖,并呈現(xiàn)濃度依賴性。而已有研究報(bào)道Rg3和Rh2均具有抗血管新生活性,抑制腫瘤生長[13-15],推測可能由于細(xì)胞類型或研究體系的不同而導(dǎo)致與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相悖。

        Nicosia于 l 984年首次報(bào)道主動(dòng)脈環(huán)血管生成模型,此模型取材簡單,便于觀察,更接近于體內(nèi)環(huán)境,是體內(nèi)外血管新生研究體系的橋梁,彌補(bǔ)了血管新生模型的缺憾[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,高濃度下的SBP、Rg3和Rh2能夠明顯促進(jìn)主動(dòng)脈環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞芽生,中、低劑量則無顯著藥效(P>0.05),這進(jìn)一步證實(shí)SBP、Rg3和Rh2的體外促進(jìn)血管新生活性,為將來的機(jī)制研究提供了理論依據(jù)。

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