汪文俊，劉 妍

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 武漢 430074)

雄甾-4-烯-3,17-二酮(4-androstene-3,17-dione，簡稱雄烯二酮或4-AD)是甾體激素類藥物不可替代的中間體，幾乎所有甾體激素藥物都能以4-AD為起始原料生產(chǎn)[1].作為前體，4-AD能繼續(xù)合成類皮質(zhì)素、雌激素、雄激素等甾體類激素藥物，是目前激素類中間體研究的熱點[2].

目前4-AD的測定方法主要有薄層層析法、氣相色譜法、高效液相色譜法和毛細色譜法等[3-7].薄層層析法準(zhǔn)確度不高且操作時間長，色譜法因其測定準(zhǔn)確、靈敏度高而被普遍采用，但設(shè)備使用維護昂貴，多樣品時操作時間長，儀器超負荷運轉(zhuǎn).依據(jù)4-AD在酸性條件下可轉(zhuǎn)化為烯醇式結(jié)構(gòu)，能與醋酐、濃硫酸發(fā)生特征性顏色反應(yīng)(Lieberman反應(yīng))的性質(zhì)[8]，本文采用濃硫酸-乙酸酐為反應(yīng)溶劑，利用分光光度計探討了4-AD快速而準(zhǔn)確測定的方法，該法測定結(jié)果準(zhǔn)確、耗時短、費用低、節(jié)約成本，具有良好的應(yīng)用前景.

1 材料與方法

1.1 試樣和儀器

雄甾-4-烯-3,17-二酮標(biāo)準(zhǔn)品(SIGMA)，測試樣為本室保存菌種Mycobacteriumneoaurum轉(zhuǎn)化植物甾醇所得4-AD萃取液，參見文獻[8].濃硫酸、乙酸酐、乙酸乙酯(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，所有試劑均為分析純.紫外分光光度計(UV-2000, 尤尼柯上海儀器有限公司)，電子分析天平(ALC-310.3, ACCULAB)，高效液相色譜儀(UltiMate 3000, 戴安公司).

1.2 溶液的配制

乙酸乙酯-濃硫酸溶液的制備：量取150 mL乙酸乙酯，緩慢加入濃硫酸10 mL，混合均勻. 4-AD標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：精確稱取4-AD標(biāo)準(zhǔn)品80 mg，用上述乙酸乙酯-濃硫酸溶液40 mL溶解，配成2.0 mg/mL的4-AD標(biāo)準(zhǔn)溶液.

1.3 濃硫酸乙酸酐法測定4-AD

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品紫外掃描

取3 mL 4-AD標(biāo)準(zhǔn)溶液于比色皿中，用紫外分光光度計進行紫外掃描，以確定4-AD的最大吸收峰.

1.3.2 線性范圍

精密吸取4-AD標(biāo)準(zhǔn)液0.2, 0.4 ,0.6 ,0.8 ,1.0,1.2 mL于試管中，分別用體積比為15︰1的乙酸乙酯-濃硫酸溶液稀釋至3 mL，搖勻，加入2 mL乙酸酐，輕輕振搖，室溫下反應(yīng)15 min，用1 cm石英比色皿，在上述確定的波長下測定吸光度.空白對照為乙酸乙酯-濃硫酸溶液3 mL，其余操作同前.根據(jù)吸光度(y)和濃度(x)關(guān)系繪圖，得4-AD的線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù).

1.3.3 精密度

精密度指用該方法重復(fù)測定同一均質(zhì)樣品所得的測定值彼此接近程度，表示分析結(jié)果的重復(fù)性，常用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示.

(1)

按上述方法，在同一天內(nèi)連續(xù)5次測定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以各組分的吸光值，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差.

1.3.4 準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確度是指用該方法測定的結(jié)果與真實值或參考值接近的程度，一般用回收率(%)表示(2).準(zhǔn)確度應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)測試，用于定量測定的分析方法均需做準(zhǔn)確度驗證.

(2)

取4-AD標(biāo)準(zhǔn)品 2 mg，采用與待測樣品相同的處理方法制備樣品，重復(fù)測定5次.利用外標(biāo)法計算出4-AD的值，進而計算出4-AD的回收率(%)和平均回收率.

1.3.5 穩(wěn)定性

精確吸取4-AD標(biāo)準(zhǔn)液1 mL，用乙酸乙酯-濃硫酸溶液稀釋至3 mL，搖勻，加入2 mL乙酸酐，輕輕振搖，室溫下反應(yīng)15 min，密封保存，分別于0 , 0.5 ,1 , 1.5 , 2 h測定吸光度.

1.3.6 樣品的測定

取3個試管，分別加入1 mL甾醇轉(zhuǎn)化液，再用3 mL乙酸乙酯萃取后取上清備用.分別取1mL上清液在沸水浴中將其蒸干，冷卻至室溫，加15︰1的乙酸乙酯濃硫酸3 mL，充分振搖使其完全溶解.其余操作與標(biāo)準(zhǔn)曲線制作法相同.利用標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程計算樣品溶液中4-AD的質(zhì)量濃度(mg/mL).上述樣品采用HPLC進行測定，方法見文獻[8].

2 結(jié)果與討論

2.1 波長的選擇

4-AD在濃硫酸存在下能發(fā)生酮式、烯醇式互變轉(zhuǎn)化生成烯醇式結(jié)構(gòu)，從而與乙酸酐、濃硫酸發(fā)生特征性顏色反應(yīng)( Lieberman反應(yīng)) .在紫外分光光度計上對4-AD的標(biāo)準(zhǔn)溶液進行紫外掃描，因吸收波長小于220 nm時，吸收干擾較大，故選定大于220 nm的波長對4-AD標(biāo)準(zhǔn)品進行全波長掃描，結(jié)果如圖1所示，圖1中4-AD在312 nm處有最大吸收峰，故選定4-AD的檢測波長為312 nm.

2.2 濃硫酸乙酸酐法測定4-AD

2.2.1 濃硫酸乙酸酐法線性檢測

在波長312 nm下，對不同濃度的4-AD標(biāo)準(zhǔn)品測定吸光度，以驗證濃硫酸乙酸酐法的線性，結(jié)果如圖2所示.由圖2算得4-AD的回歸方程為：y= 0.714x(y為吸光值，x為4-AD濃度)，相關(guān)系數(shù)R2= 0.9993.說明在0.08～0.48 mg/mL范圍內(nèi)，4-AD的吸光值與濃度的線性關(guān)系良好.

λ/nm圖1 4-AD標(biāo)準(zhǔn)品的紫外全波長掃描圖Fig.1 The scanning curve of 4-AD standard under ultraviolet broad spctrum

ρ(4-AD)/(mg·mL-1)圖2 4-AD標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The 4-AD standard curve analysis

2.2.2 精密度試驗

在波長312 nm下，在0.08 ～ 0.48 mg/mL范圍內(nèi)，選取樣品濃度為0.48 mg/mL，通過測定其吸光值，研究了測定結(jié)果的精密度實驗，結(jié)果見表1.由表1可算得4-AD的RSD為0.672%，說明該方法精密度較高.

2.2.3 準(zhǔn)確度試驗

在波長312 nm下，加入2.00 mg標(biāo)準(zhǔn)品，按上述方法配置成濃度為0.40 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在0.08～0.48 mg/mL范圍內(nèi)，測定其吸光值，研究了測定結(jié)果的準(zhǔn)確度實驗，結(jié)果如表2所示.可見4-AD的平均回收率為99.69%，說明該方法準(zhǔn)確度較高，可滿足科研工作及生產(chǎn)中常規(guī)測定的要求.

2.2.4 穩(wěn)定性驗證

在波長312 nm下，在0.08～0.48 mg/mL范圍內(nèi)，選取樣品濃度為0.40 mg/mL，通過測定其吸光值，研究了測定結(jié)果的穩(wěn)定性實驗，結(jié)果如表3所示.表3中可見RSD為1.968%，表明供試品溶液在2 h內(nèi)是穩(wěn)定的.

表1 4-AD精密度

表2 4-AD回收率

表3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Tab.3 Results of stability test

2.2.5 樣品測定

在波長312 nm下，對樣品含量進行測定，測得樣品的濃度分別為：1.548, 1.545, 1.547 mg/mL樣品測得的含量相差不大，平均濃度為(1.547±0.002) mg/mL，與HPLC測定結(jié)果(1.545±0.002) mg/mL相比，p>0.05，無顯著差異，說明該法可用于樣品的測定，結(jié)果可靠，可用于將來的工業(yè)化生產(chǎn)中的常規(guī)測試.

3 結(jié)語

本文建立的雄甾-4-烯-3,17-二酮的濃硫酸乙酸酐-分光光度法，利用其Lieberman反應(yīng)，在312 nm處有最大吸收值的特征，通過測定吸光值，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，回收率較高，精密度良好，樣品檢測結(jié)果與HPLC檢測結(jié)果之間差異不顯著，可用此法于雄甾-4-烯-3,17-二酮的檢測，具有良好的應(yīng)用前景.

參 考 文 獻

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