尹越，張曌玥，牟笑，吳詩，毛朝明，陳德玉

（1.江蘇大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212001；2.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤研究院，江蘇鎮(zhèn)江212001）

肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄子-1和核因子-κB在食管鱗癌組織中的表達及其相關(guān)性

尹越1，張曌玥1，牟笑1，吳詩1，毛朝明2，陳德玉2

（1.江蘇大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212001；2.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤研究院，江蘇鎮(zhèn)江212001）

目的：研究肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄子-1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript1，MALAT-1）和核因子-κB（NF-κB）在食管鱗狀細胞癌（鱗癌）組織中的表達及其相關(guān)性。方法：采用qRT-PCR技術(shù)檢測60例食管鱗癌組織和癌旁組織中MALAT-1和NF-κB的mRNA水平的表達，免疫組化SP方法檢測NF-κB的蛋白表達水平。統(tǒng)計分析MALAT-1及NF-κB與患者臨床病理特征之間的關(guān)系以及兩者的相關(guān)性。結(jié)果：MALAT-1和NF-κB mRNA在60例食管鱗癌組織中的表達均高于癌旁組織（Z＝－3.600，P＜0.001；Z＝－2.856，P＜0.05），且NF-κB蛋白在食管鱗癌組織中的陽性表達率顯著高于癌旁組織（χ2＝36.39，P＜0.001）。MALAT-1、NF-κB的表達均與食管鱗癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期密切相關(guān)（P＜0.05）。MALAT-1與NF-κB之間存在正相關(guān)（r＝0.795，P＜0.001）。結(jié)論：長鏈非編碼RNA MALAT-1可能在食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄子-1；核因子-κB；食管鱗狀細胞癌；臨床病理特征

食管癌死亡率居于全球惡性腫瘤致死率第6位［1］。其發(fā)生與發(fā)展是多因素的復(fù)雜過程，在分子水平上涉及眾多基因及蛋白質(zhì)的改變，甚至部分RNA的變化。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 bp的非編碼RNA，本身并不參與編碼蛋白質(zhì)，而是在基因表觀遺傳學(xué)修飾、蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄與翻譯等多層面發(fā)揮調(diào)控作用［2］。最新研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄子-1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT-1）作為lncRNA家族中的一員，在腦、骨髓、食管、膽囊、卵巢等組織的惡性腫瘤中均出現(xiàn)升高［3］。現(xiàn)有資料表明，lncRNA還參與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲、凋亡等過程［4－5］。但是，對于MALAT-1在食管癌中的作用機制和生物學(xué)功能尚不清楚。本實驗采用qRT-PCR技術(shù)檢測60例食管鱗癌患者癌組織和癌旁組織中的MALAT-1和核因子-κB（NF-κB）的mRNA表達水平，采用免疫組化技術(shù)檢測NF-κB的蛋白表達水平，并分析兩者與患者臨床病理特征之間的關(guān)系以及兩者之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

收集江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科2012年1月至2013年11月60例食管鱗癌患者的新鮮手術(shù)標本，術(shù)后經(jīng)病理證實為食管鱗癌。癌旁組織選取距離腫塊邊緣5 cm的正常組織。術(shù)前未行放化療。組織取出后立即置入－80℃冰箱凍存。研究過程嚴格遵循江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會關(guān)于人體試驗的倫理學(xué)標準并均獲得入選對象的知情同意。

1.2 MALAT-1和NF-κB的qRT-PCR

采用Trizol試劑提取標本的總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明，使用10μL反應(yīng)體系進行cDNA的合成。并使用25μL體系進行PCR反應(yīng)。用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。所有引物序列如下，MALAT-1上游引物：5′-ACTACTTTTTGCCTCCCTCACA-3′，下游引物：5′-AACTTATCTGCGGTTTCCTCAA-3′，產(chǎn)物長度為174 bp。NF-κB上游引物：5′-GGAGCACAGATACCACCAAGA-3′，下游引物：5′-CGCTTCTTCACACACTGGATT-3′，產(chǎn)物長度為223 bp。GAPDH上游引物：5′-TCAACGGATTTGGTCGTATTG-3′，下游引物：5′-TGGGTGGAATCAT-ATTGGAAC-3′，產(chǎn)物長度為136 bp。

1.3 NF-κB的免疫組織化學(xué)染色

采用鏈霉菌抗生物素蛋白 過氧化物酶連結(jié)（SP）法。對60例食管鱗癌組織依次進行低聚甲醛固定、石蠟包埋、連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟、水化，抗原修復(fù)，血清封閉；然后進行兔抗人NF-κB（p65／REAL）多克隆抗體4℃孵育過夜。采用即用型快捷免疫組化試劑盒中二抗，按照說明書操作，室溫孵育30 min，DAB顯色5～10 min，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、干燥、封片，光鏡下觀察。用PBS代替一抗作為陰性對照。

結(jié)果判定：NF-κB免疫組化染色陽性產(chǎn)物主要定位于細胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色。根據(jù)陽性細胞所占百分比，無明顯陽性反應(yīng)細胞為陰性（－），陽性細胞百分率＜25%為弱陽性（＋），25%～75%為中等陽性（＋＋），＞75%為強陽性（＋＋＋）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

使用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析。對于非正態(tài)分布，經(jīng)Wilcoxon檢驗和Mann-Whitney U檢驗分析。對于正態(tài)分布使用t檢驗。計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗和Fisher確切概率法。MALAT-1與NF-κB的相對表達量（2－ΔΔCt）經(jīng)log2正態(tài)性轉(zhuǎn)換后采用Pearson′s相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌組織和癌旁組織中MALAT-1和NF-κB的mRNA表達情況

MALAT-1和NF-κB擴增曲線良好，熔解曲線均為單峰，產(chǎn)物的特異性好（圖1）。將食管鱗癌組織和癌旁組織的PCR結(jié)果進行統(tǒng)計分析，顯示在食管鱗癌組織中MALAT-1和NF-κB的mRNA表達均高于癌旁組織（Z＝－3.600，P＜0.001；Z＝－2.856，P＜0.05）（圖2）。

2.2 NF-κB蛋白的免疫組化結(jié)果

在60例食管鱗癌組織中，NF-κB蛋白表達陰性12例，弱陽性32例，中等陽性16例，強陽性0例。而在相應(yīng)的癌旁組織中NF-κB的蛋白表達陰性45例，弱陽性11例，中等陽性4例，強陽性0例。NF-κB在食管鱗癌癌組織中的陽性表達率（48／60）顯著高于癌旁組織（15／60）（χ2＝36.39，P＜0.001）。NF-κB免疫組化染色的陽性產(chǎn)物主要定位于細胞質(zhì)，呈棕黃色（圖3）。

2.3 MALAT-1和NF-κB的mRNA表達與食管鱗癌臨床病理相關(guān)性分析

食管鱗癌組織和癌旁組織中MALAT-1和NF-κBmRNA水平的表達與患者的性別、年齡、腫瘤位置均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)（P＜0.05）。見表1。

圖1 實時熒光定量PCR曲線

圖2 MALAT-1和NF-κB在食管鱗癌組織和癌旁組織中的表達

圖3 NF-κB免疫組化染色結(jié)果（SP法×400）

2.4 NF-κB蛋白表達與食管鱗癌臨床病理相關(guān)性分析

食管鱗癌組織中NF-κB蛋白水平的表達與患者的性別、年齡、腫瘤位置均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)（P＜0.05）。見表2。

2.5 NF-κB與MALAT-1表達的相關(guān)性分析

將MALAT-1與NF-κB mRNA的相對表達量通過log2正態(tài)性轉(zhuǎn)換后，行Pearson′s相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)MALAT-1與NF-κB在mRNA水平上存在正相關(guān)（r＝0.795，P＜0.001）。見圖4。此外MALAT-1在鱗癌組織中的表達與NF-κB蛋白水平的表達相關(guān)，NF-κB蛋白陽性組（48例）MALAT-1的相對表達量為0.017，高于NF-κB蛋白陰性組（12例）的0.006的表達量（t＝7.916，P＜0.001）。

圖4 MALAT-1和NF-κB m RNA表達的相關(guān)性

3 討論

MALAT-1作為lncRNA家族中的一員，其基因位于染色體11q13，而該區(qū)域又與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［6］。同時，MALAT-1是首個被發(fā)現(xiàn)的與腫瘤轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)的lncRNA［7］。近年研究顯示，MALAT-1與許多惡性腫瘤密切相關(guān)，并且參與了腫瘤細胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和分化等多種生物學(xué)過程［5，8］。在小細胞肺癌中，MALAT-1與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［9］；在宮頸癌中，通過調(diào)控Caspase-3、Bax、Bcl-2等促進腫瘤的增殖［10］；MALAT-1還通過調(diào)控抑癌基因p53的表達參與到腫瘤的形成［11］；在前列腺癌中，MALAT-1通過參與細胞周期的調(diào)控來促進腫瘤細胞的增長、侵襲與擴散［12］。NF-κB作為一個重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的多項調(diào)節(jié)，包括腫瘤的轉(zhuǎn)移、擴散增殖及抑制凋亡等［13］。例如凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Bcl-2，侵襲轉(zhuǎn)移最直接最重要的基質(zhì)金屬蛋白酶9等均為NF-κB的下游靶基因［14－16］。現(xiàn)有研究證實NF-κB在食管癌的發(fā)生發(fā)展中起了重要的作用［17－18］。

表1 MALAT-1和NF-κB的m RNA表達與食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系

表2 NF-κB的蛋白表達與食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系

本實驗結(jié)果表明在食管鱗癌組織中MALAT-1的mRNA表達水平高于癌旁組織，且與食管鱗癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)。提示MALAT-1在食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展中起作用。同時食管鱗癌組織中NF-κB的mRNA水平和蛋白水平的表達也均高于癌旁組織，而且NF-κB的mRNA水平和蛋白水平的表達也均與食管鱗癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)。Pearson′s相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn)，MALAT-1和NF-κB間存在正相關(guān)關(guān)系，且NF-κB蛋白陽性組的MALAT-1的表達量高于陰性組。表明在食管鱗癌中，高表達的MALAT-1可能與同樣高表達的NF-κB相互作用，導(dǎo)致了食管鱗癌的發(fā)生。但是兩者間的調(diào)控與被調(diào)控機制并不清楚，下一步將通過體外細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染等實驗來進一步研究。

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Expressions and correlations of lncRNA MALAT-1 and NF-κB in patients w ith esophageal squamous cell carcinoma

YIN Yue1，ZHANG Zhao-yue1，MOU Xiao1，WU Shi1，MAO Chao-ming2，CHEN De-yu2
（1.School of Clinical Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001；2.Institute of Oncology，the Affiliated Hospital of Jiangsu U-niversity，Zhenjiang Jiangsu 212001，China）

Objective：To evaluate the expression and correlations ofmetastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1（MALAT-1），and NF-κB in the esophageal squamous cell carcinoma（ESCC）tissue.M ethods：The expressions of MALAT-1 and NF-κB mRNA were detected by qRT-PCR in 60 ESCC tissues and adjacent non-tumorous tissues.The expression of NF-κB protein was detected by immunohistochemical staining（SPmethod），and the relationship between MALAT-1 and clinico-pathological feature of ESCC patientswas analyzed，and the correlation was explored.Results：The expression of MALAT-1 and NF-κB both were higher in ESCC tissues than that in adjacent non-tumorous tissues（Z＝－3.600，P＜0.001；Z＝－2.856，P＜0.05）.The positive rate of NF-κB protein in ESCC tissues was significantly higher than that in adjacent non-tumor tissues（χ2＝36.39，P＜0.001）.Meanwhile，the higher expression of MALAT-1 and NF-κB were correlated with the differentiation degree，lymphnode metastasis and clinical stage of ESCC（P＜0.05）.And the expression of MALAT-1 and NF-κB was positive correlated（r＝0.795，P＜0.001）.Conclusion：MALAT-1 might play a significant role in the occurrence and development of ESCC.

metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript1；NF-κB；esophageal squamous cell carcinoma；clinicopathological features

尹越（1988—），女，碩士研究生；陳德玉（通訊作者），教授，主任醫(yī)師，E-mail：cdeyu＠hotmail.com

R735.1

A

1671－7783（2014）02－0129－05

10.13312／j.issn.1671-7783.y130264

鎮(zhèn)江市社會發(fā)展支撐計劃項目（SH2011019，SH2012023）

2013－11－27 ［編輯］ 何承志