陳強，吳春雪，余曉君，李紅，朱春暉，劉曉艷

（1.江西省兒童醫(yī)院內(nèi)科，江西南昌330006；2.江西省兒童醫(yī)院檢驗科，江西南昌330006；3.江西省兒童醫(yī)院中心實驗室，江西南昌330006；4.南昌大學醫(yī)學部，江西南昌330006）

鼠傷寒沙門菌spvC基因缺陷變異株的制備

陳強1，吳春雪1，余曉君2，李紅3，朱春暉1，劉曉艷4

（1.江西省兒童醫(yī)院內(nèi)科，江西南昌330006；2.江西省兒童醫(yī)院檢驗科，江西南昌330006；3.江西省兒童醫(yī)院中心實驗室，江西南昌330006；4.南昌大學醫(yī)學部，江西南昌330006）

目的：為進一步研究鼠傷寒沙門菌毒力基因spvC的功能，制備鼠傷寒沙門菌spvC基因缺陷變異株。方法：根據(jù)鼠傷寒沙門菌spvC基因序列，設計PCR特異性引物，制備spvC基因缺陷性同源性核苷酸片段，導入自殺質粒pCVD442后再導入鼠傷寒沙門菌野生株，進行同源重組，用PCR觀察重組現(xiàn)象，將完全重組的菌株作為spvC基因的缺陷變異株，并通過核苷酸序列分析加以確定。結果：PCR及序列分析證實，缺陷變異株的spvC基因缺失711個堿基。結論：成功構建鼠傷寒沙門菌spvC基因缺陷變異株，為進一步研究其在鼠傷寒沙門菌中的功能奠定了基礎。

鼠傷寒沙門菌；spv C；基因缺陷變異；同源重組

在所有的致病沙門菌毒力質粒上均有一大小約8 kb的高度保守序列，即沙門菌質粒毒力基因spv（Salmonella plasmid virulence gene），既往研究發(fā)現(xiàn)它編碼的產(chǎn)物與細菌毒力表型密切相關，并與細菌血清抗性及其黏附、定居能力相關［1－3］。spv基因包含R、A、B、C、D等5個開放閱讀框［4］。spv五大結構基因中對細菌毒力有重要影響的基因為spvB、 spvC，后兩者的編碼產(chǎn)物均通過沙門菌毒力島Ⅱ編碼的Ⅲ型分泌系統(tǒng)（typeⅢprotein secretion systems，TTSS）進入宿主細胞，從而發(fā)揮其毒力效應［5］。

盡管SpvB和SpvC有不同的、表面上不相關的生物學功能，但兩者都與spv毒力表型相關［6］，它們影響了細胞內(nèi)沙門菌感染發(fā)病機制的共同胞內(nèi)信號通路。近年研究發(fā)現(xiàn)兩者均可阻止NADPH氧化酶募集至吞噬體，且均可誘導巨噬細胞凋亡［5－8］。spvC基因編碼的SpvC蛋白及相關效應因子具有磷酸蘇氨酸裂解酶活性［7－8］，但該基因在沙門菌發(fā)病機制中的許多功能以及是否與spvB發(fā)揮協(xié)同作用尚不清楚。為此，我們構建了野生型鼠傷寒沙門菌spvC基因缺陷變異株，對進一步深入研究spvC的功能具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒

野生型鼠傷寒沙門菌株211為目的菌（從我們前期研究的臨床腹瀉患者糞便中分離的鼠傷寒沙門菌［9］）；大腸埃希菌E.coli DH5α購自北京天根生物有限公司；大腸埃希菌SM10λpir及自殺質粒pCVD442由美國洛杉磯兒童醫(yī)院黃勝和教授及南方醫(yī)科大學曹虹教授惠贈。

1.2 主要試劑

細菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱）購自北京天根生物有限公司；DNA聚合酶試劑盒購自Qiagen公司；限制性內(nèi)切酶Eco R I、SalⅠ、SphⅠ、Eco R V、T4DNA連接酶、DL5000購自寶生物工程TaKaRa大連公司；質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自Promeg公司。

1.3 主要儀器

凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）；紫外線透射臺（上海路陽儀器有限公司）；PCR擴增儀（Bio-Rad公司）；高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）。

1.4 方法

1.4.1 PCR引物設計

查詢基因庫公布的鼠傷寒沙門菌spv C基因的上、下游核苷酸序列，設計2對特異性的PCR引物P1A／1B和P2A／2B。如表1所示，在P2A、P1B的5′末端均加上Eco R V酶切位點，在P1A、P2B的5′末端分別加上Sph I、Sal I酶切位點，以便于連接片段的定向連接及克隆，最后在所有引物的5′末端加接3～4個保護性堿基。引物在上海生工生物技術公司合成。

表1 spv C基因PCR引物及序列

1.4.2 spv C基因缺陷同源性核苷酸片段的克隆

以野生型鼠傷寒沙門菌211的DNA為模板，用spvC基因的上游核苷酸片段引物P1A／P1B和下游核苷酸片段引物P2A／P2B分別進行PCR擴增，獲取spvC基因的上、下游DNA片段F1、F2，割膠純化回收PCR產(chǎn)物后分別與pMD18-T載體連接，即構建重組質粒pMD-F1及pMD-F2，分別轉化至E.coli DH5α感受態(tài)細菌，篩選陽性克隆，提取質粒，送檢測序鑒定正確后，分別用Sal I和Eco R V雙酶切質粒pMD-F1、pMD-F2，割膠純化線性載體pMD-F1及片段F2，用T4DNA連接酶進行定向連接，重新構建載體，即pMD-F1-F2，轉化至E.coli DH5α感受態(tài)細菌，篩選陽性克隆，并用酶切及PCR方法進行鑒定。其中F1-F2片段即為spvC基因缺陷性同源核苷酸片段。

1.4.3 spv C基因缺陷性同源性核苷酸片段與自殺質粒的連接

用Sal I、Sph I內(nèi)切酶分別雙酶切載體pMD-F1-F2及自殺質粒pCVD442，割膠純化回收同源性核苷酸片段F1-F2及自殺質粒，再用T4DNA連接酶進行定向連接。將連接產(chǎn)物轉化入經(jīng)CaCl2法制備的感受態(tài)細菌SM10λpir中。利用自殺質粒帶有氨芐西林抗性來篩選陽性克隆，使用酚氯仿異戊醇初篩后提取陽性重組自殺質粒。最后經(jīng)單、雙酶切及PCR擴增鑒定重組自殺質粒pCVD-F1-F2。

1.4.4 重組突變株的篩選

根據(jù)文獻［10］的方法，二步法篩選基因缺失變異株。以鼠傷寒沙門菌作為受體菌，含有重組自殺質粒的SM10λpir細菌作為供體菌，通過接合轉移的方法［11］將重組自殺質粒導入鼠傷寒沙門菌。利用自殺質粒帶有氨芐西林抗性及SS平板對大腸埃希菌的抑制作用，在含有氨芐西林的SS平板上篩選陽性克隆菌落。增菌培養(yǎng)后，接種在含5%蔗糖的無抗性LB平板上，利用自殺質粒本身具有sacB基因的特性誘導重組作用，在平板上篩選耐蔗糖菌落。因制備的spvC基因缺陷性同源性核苷酸片段缺失711 bp，明顯小于原spvC基因片段，使用PCR方法觀察鼠傷寒沙門菌spvC基因的重組現(xiàn)象，篩選重組變異株連續(xù)傳代培養(yǎng)，我們將連續(xù)3次傳代都穩(wěn)定的有spvC基因缺陷的重組菌株作為spvC基因缺陷變異株。

2 結果

2.1 PCR擴增spvC基因上、下游片段

以鼠傷寒沙門菌211的DNA為模板，經(jīng)PCR擴增（特異性引物P1A／P1B和P2A／P2B）分別獲得spvC基因的上、下游同源性核苷酸片段F1（1 025 bp）和F2（1 011 bp），見圖1。切膠純化回收PCR產(chǎn)物后分別與pMD18-T載體連接，獲得陽性克隆的質粒，即pMD-F1、pMD-F2。

圖1 鼠傷寒沙門菌spvC基因上下游片段（F1、F2）PCR擴增結果

2.2 spvC基因缺陷同源性核苷酸片段的克隆

經(jīng)SalⅠ及Eco R V分別雙酶切pMD-F1、pMDF2，并割膠純化回收線性載體pMD-F1及片段F2，經(jīng)T4DNA連接酶定向連接，即重組成含有F1-F2片段的T載體，轉化入感受態(tài)大腸埃希菌E.coli DH5α細菌。將轉化產(chǎn)物在氨芐西林平板上培養(yǎng)過夜，再利用環(huán)狀T載體具有氨芐西林抗性及陽性重組T載體與原載體相對分子質量的差異，使用酚／氯仿／異戊醇初篩出質粒，結果見圖2；第2、7、8道電泳為可疑陽性重組克隆，挑取第7道電泳可疑陽性克隆質粒，經(jīng)Sal I單酶切、Sal I及Sph I雙酶切、PCR擴增鑒定，結果見圖3。

2.3 spv C同源性缺陷性核苷酸片段克隆至自殺質粒

圖2 重組pMD18-T質粒陽性克隆的初篩

圖3 重組T載體的酶切、PCR鑒定

分別經(jīng)SalⅠ、SphⅠ雙酶切含有同源重組片段F1-F2的T載體及自殺質粒pCVD442，割膠純化回收酶切產(chǎn)物，轉化至經(jīng)CaCl2制備的SM10λpir感受態(tài)細菌，用氨芐西林篩選陽性克隆、酚氯仿異戊醇篩選結果見圖4 （5道泳道均為可疑陽性重組自殺質粒）。提取第1道重組的陽性自殺質粒，經(jīng)單雙酶切鑒定和PCR擴增后電泳鑒定，結果顯示經(jīng)Eco RⅠ單酶切后的所有片段長度總和為8.3 kb左右，經(jīng)SalⅠ和SphⅠ雙酶切重組質粒后大約有2.0 kb的片段被切下，PCR擴增（spvC基因特異性引物P1A、P2B）也獲得約同樣大小的片段，見圖5。

2.4 突變株的制備及鑒定

圖4 自殺質粒陽性克隆初篩

在含有氨芐西林的SS平板上篩選轉導后的陽性克隆菌落，過夜增菌培養(yǎng)后，接種在5%蔗糖的無抗性LB平板上篩選耐蔗糖菌落。用spvC上下游引物P1A、P2B進行PCR擴增，從而觀察沙門菌的重組現(xiàn)象。圖6A為首次經(jīng)5%蔗糖LB平板篩選獲得的菌落PCR觀察結果，其中第1、5泳道的細菌沒有發(fā)生重組現(xiàn)象，第2、3和4泳道的細菌PCR擴增可見大小2個片段，為共價整合體，即原基因還沒被完全替換。圖6B為取圖6A中的第2泳道的細菌經(jīng)第2、3次LB蔗糖平板篩選的菌株PCR結果以及此后連續(xù)3次培養(yǎng)后菌落PCR鑒定結果，PCR結果說明細菌已發(fā)生了完全同源重組變異，且連續(xù)傳代3次均穩(wěn)定。

圖5 重組自殺質粒的酶切、PCR鑒定

圖6 spv C基因缺陷變異株的PCR篩選

3 討論

腸炎沙門菌是引起人類食物中毒的最主要原因之一，絕大多數(shù)沙門菌對人和動物有致病性，能引起急性、危及生命的系統(tǒng)感染性疾病。近年來，應用分子生物學技術制備特異性的基因缺陷變異株已經(jīng)成為研究傷寒沙門菌致病性的重要方法。

20世紀80年代發(fā)展起來的染色體基因修飾技術，即利用高效自殺載體系統(tǒng)的同源重組技術，基本原理是構建含有一定長度同源性核苷酸片段的重組自殺質粒，利用宿主自身的重組系統(tǒng)與同源重組序列進行交換，在兩次重組過程中由于自殺質粒的性質上述的重組質粒進一步丟失，從而完成重組［12］。同源重組的效率很低，靶基因兩端的片段對重組效率的影響很大，片段越長，重組率越高，但克隆難度也相對越大。此外，敲除成功與否還取決于基因敲除載體是否線性化、靶基因在基因組中的位置以及靶基因的結構等等。在此實驗中，我們設計了兩對特異性引物P1A／1B和P2A／2B，分別擴增spvC基因的上、下游片段，且在引物末端加特異性酶切位點，以利于基因片段的線性定向連接，免受限制性核苷酸內(nèi)切酶酶切位點選擇的限制，因此可自由控制基因缺損的部位，使得敲除的spvC基因堿基數(shù)（711 bp）為3的倍數(shù)，這樣不至于出現(xiàn)下游基因的移碼現(xiàn)象。另外，為提高同源重組效率，我們制備的spvC基因的同源缺陷核苷酸片段長2 kb左右。

自殺質粒是一種通過同源重組技術構建細菌基因精確缺失株的有效載體［10］。本研究中通過自殺質粒pCVD442介導同源重組技術，制備了鼠傷寒沙門菌特異性spvC基因缺陷變異株。pCVD442具有幾個獨特的功能性元件［13］：有缺陷的復制子（oriR6K），使得自殺質粒只能在提供pir蛋白的宿主菌中復制；能進行誘導的順式功能元件（mobRP4），能夠誘導細菌結合使質粒在細菌間直接轉移；蔗糖選擇基因（sacBR）可編碼一種果糖聚蔗糖酶，從而催化蔗糖水解為果聚糖，后者對許多G－細菌是一種致死性的有毒物質，所以sacBR可成為去除自殺質粒pCVD442的一個反向選擇基因。在蔗糖培養(yǎng)基上生長的耐蔗糖菌株含有目的基因回復突變株或目的基因缺失突變株，利用菌落PCR擴增篩選，將連續(xù)3次或以上篩選培養(yǎng)穩(wěn)定，出現(xiàn)目的基因缺失的菌株作為特異性目的基因缺陷變異株。本研究采用接合轉移［11］將拷貝數(shù)相對較大的大質粒導入野生型鼠傷寒沙門菌中，在含有氨芐青霉素的SS平板上僅培養(yǎng)出數(shù)個產(chǎn)硫化氫的黑色菌落，將黑色菌落接種于5%蔗糖無抗性LB平板上，利用自殺質粒的sacB基因特性來誘導同源基因重組，最后接種在5%蔗糖LB平板上并連續(xù)過夜培養(yǎng)3次，PCR擴增篩選鑒定完全重組菌落，通過基因測序分析進一步證實此菌落即為穩(wěn)定的spvC基因缺陷變異株。

致病沙門菌的質粒毒力基因spv中spvB和spvC是對細菌毒力有重要影響的基因，兩者對細胞內(nèi)沙門菌感染發(fā)病機制有共同胞內(nèi)信號通路。spvB編碼的產(chǎn)物SpvB蛋白具有ADP核糖基轉移酶活性，介導的肌動蛋白解聚可能阻止NADPH氧化酶組裝募集至吞噬體，從而降低沙門菌的氧化殺傷作用，另外可以誘導凋亡［5，14］；spvC編碼產(chǎn)物SpvC蛋白及其相關的效應因子具有磷酸蘇氨酸裂解酶活性，使Erk（pErk）、p38和JNK去磷酸化，從而干擾絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑［7－8］，阻止抗凋亡因子的合成并觸發(fā)凋亡，這與SpvB的功能一致。因此，巨噬細胞凋亡可能是SpvB和SpvC作用的共同通路。另外，SpvC可能阻止MAPK同工酶的促炎癥信號，導致主要的巨噬細胞激活細胞因子如IL-8、TNF-α水平下降［5，8］；有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）缺失的小鼠感染沙門菌后癥狀更嚴重，且TNF可以促進NADPH氧化酶定位至沙門菌感染的巨噬細胞的吞噬體［15］。因此，SpvC可能與SpvB一起發(fā)揮阻止功能性的NADPH氧化酶募集至吞噬細胞的作用。spvC基因缺陷變異株的成功構建，為進一步深入研究spvC在鼠傷寒沙門菌致病機制中的作用奠定了基礎。

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Construction of a spv C gene-deleted mutant in Salmonella enterica serovar Typhi

CHEN Qiang1，WU Chun-xue1，YU Xiao-jun2，LIHong3，ZHU Chun-hui1，LIU Xiao-yan4
（1.Department of Internal Medicine，Jiangxi Children′s Hospital，Nanchang Jiangxi 330006；2.Department of Clinical Laboratory，Jiangxi Children′s Hospital，Nanchang Jiangxi330006；3.Department of Laboratory Center，Jiangxi Children′s Hospital，Nanchang Jiangxi330006；4.Medical Board of Nanchang University，Nanchang Jiangxi330006，China）

Objective：To investigate the function of spvC gene，the deletion mutant of the spvC gene was constructed in Salmonella enterica serovar Typhi.M ethods：As the genomic information，two pair′s primerswere designed，upper-and down-stream of the spvC gene to amplify two homologous DNA fragments.The homologous recombinant DNA fragment of the defective target gene was cloned into the suicide plasmid pCVD442 which was then transferred into the target cell of S.enterica serovar Typhi.The recombination was visualized by PCR，and the complete recombinant strain was selected as the spvC gene deleted mutant strain and confirmed by the corresponding sequencing analysis.Results：A deletion of 711 bp of the spvC genewas confirmed by PCR and sequencing analysis.Conclusion：The spvC gene-deleted mutant of S.enterica serovar Typhiwas generated successfully，and itwas a foundation to study the detail functions of the spvC gene in S.enterica serovar Typhi.

Salmonella enterica serovar Typhi；spvC；gene deletionmutation；homologous recombination

R378.22

A

1671－7783（2014）03－0235－05

10.13312／j.issn.1671-7783.y140054

江西省自然科學基金資助項目（20132BAB205036）

陳強（1961—），女，江西南昌人，主任醫(yī)師，碩士生導師，E-mail：jx-cq＠163.com

2014－03－15 ［編輯］ 陳海林