劉玲玲，趙龍，李曉麗，張贏予，王好，周艷芳，張國輝

（江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇鎮(zhèn)江212002）

MSCs旁分泌對多柔比星誘導(dǎo)的H9C2細胞凋亡的影響

劉玲玲，趙龍，李曉麗，張贏予，王好，周艷芳，張國輝

（江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇鎮(zhèn)江212002）

目的：探討骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）旁分泌因子肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）對多柔比星誘導(dǎo)的H9C2細胞凋亡的影響及其機制。方法：將SD大鼠MSCs傳代至第3代后分為未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染HGF-siRNA組及轉(zhuǎn)染陰性對照（NC）-siRNA組，分別進行相應(yīng)處理。通過ELISA、蛋白質(zhì)印跡法檢測各組MSCs細胞上清中及細胞中HGF、轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）含量和蛋白表達量。用濃度為1μmol／L的多柔比星處理H9C2細胞4 h后分為4組：單獨培養(yǎng)組、MSCs共培養(yǎng)組、與HGF-siRNA-MSCs共培養(yǎng)組及與NC-siRNA-MSCs共培養(yǎng)組。培養(yǎng)24 h后通過流式細胞術(shù)AnnexinⅤ／PI雙染法檢測H9C2細胞凋亡率。結(jié)果：HGF-siRNA組MSCs上清中TGF-β1濃度為（519.23±24.34）pg／mL，明顯高于未轉(zhuǎn)染組［（459.65±11.78）pg／mL］及NC-siRNA組［（459.33±11.78）pg／mL］（P均＜0.05）；轉(zhuǎn)染HGF-siRNA組MSCs中TGF-β1表達量亦明顯高于其他兩組。HGF-siRNA-MSCs與H9C2細胞共培養(yǎng)組中H9C2細胞凋亡率為（18.54±0.64）%，較MSCs共培養(yǎng)組［（6.65± 0.49）%］及NC-siRNA-MSCs共培養(yǎng)組［（9.70±1.62）%］明顯增加（P均＜0.05）。結(jié)論：MSCs旁分泌因子HGF通過抑制TGF-β1的表達對多柔比星誘導(dǎo)的H9C2細胞凋亡起保護作用。

骨髓間充質(zhì)干細胞；旁分泌；肝細胞生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子-β1；細胞凋亡；多柔比星

骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells， MSCs）是一種來源于骨髓間質(zhì)的多功能干細胞，具有向多種細胞分化的潛能。最初對其在心臟疾病方面的研究側(cè)重于MSCs向心肌細胞的分化，但越來越多的文獻報道，MSCs向心肌細胞分化的數(shù)量極少［1］，不足以解釋其對心臟功能的恢復(fù)作用，且發(fā)現(xiàn)MSCs可分泌較多的細胞因子［2］。目前已被確認(rèn)的細胞因子包括肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF），胰島素樣生長因子，基質(zhì)細胞衍生因子，血管內(nèi)皮生長因子，堿性成纖維細胞生長因子，轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）等近40種。HGF具有抗心肌細胞凋亡、促進血管再生的作用。TGF-β1在心臟損傷、修復(fù)以及心臟重構(gòu)中起著關(guān)鍵作用。TGF-β1除了促進心肌肥大和纖維化，還能導(dǎo)致心肌細胞凋亡［3］。

本課題組在近幾年的研究中初步探討了HGF對多柔比星誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡有明顯的保護作用［4］。相反，TGF-β1能促進心肌細胞的凋亡［5］，而通過抑制MSCs中TGF-β1的表達，能顯著降低多柔比星誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡率。在前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們設(shè)想HGF對心肌細胞的保護作用除了直接抑制細胞凋亡外，是否會抑制MSCs分泌TGF-β1呢？

本實驗通過轉(zhuǎn)染siRNA，從后轉(zhuǎn)錄水平抑制MSCs中HGF的表達，觀察MSCs旁分泌因子對多柔比星誘導(dǎo)的H9C2細胞凋亡的影響并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

4～6周齡SD大鼠，由江蘇大學(xué)實驗動物中心提供［實驗動物許可證號：SYXK（蘇）2008－0024］。H9C2細胞株購于中國科學(xué)院上海細胞庫。

鹽酸多柔比星購自美國Enzo公司；HGF-siRNA由上海吉瑪公司設(shè)計并合成；大鼠HGF、TGF-β1ELISA試劑盒購自上海奇康生物科技公司；兔抗大鼠HGF-IgG購自美國Santa Cruz公司，兔抗大鼠TGF-β1-IgG、GAPDH-IgG、山羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司；eECL高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司；AnnexinⅤ／PI雙染凋亡試劑盒購自南京厚載生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠原代MSCs的分離和培養(yǎng) 頸椎脫臼法處死大鼠，取出雙側(cè)股骨和腓骨并顯露骨髓腔。用5 mL注射器抽取無血清DMEM-F12沖洗骨髓腔。將收集的細胞懸液過濾、離心，棄上清，用含10%胎牛血清的DMEF-F12重懸細胞，以107／mL密度接種于10 cm培養(yǎng)皿，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合達80%～90%時進行首次傳代培養(yǎng)。取培養(yǎng)至第3代的MSCs用于后續(xù)實驗。

1.2.2 H9C2細胞的培養(yǎng) 將H9C2細胞株以107／mL細胞密度接種于10 cm培養(yǎng)皿后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞達80%～90%融合時以1∶2傳代培養(yǎng)。

1.2.3 MSCs siRNA轉(zhuǎn)染方法 轉(zhuǎn)染前1天將第3代MSCs以2×104／mL的密度接種到6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。次日，待細胞融合達70%～80%，取HGF-siRNA稀釋液2μL于EP管中，加入200μL無血清的DMEM-F12混勻。取Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑5μL，加入250μL DMEM-F12培養(yǎng)基混勻后室溫下孵育5 min。將以上兩種液體混勻后室溫下孵育20 min，再重新接種到6孔板中，加入1 550μL無血清的DMEM-F12培養(yǎng)基，混勻后置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。12 h后換為含10%血清的DMEM-F12培養(yǎng)，24 h后熒光電子顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，并收集上清及細胞進行后續(xù)試驗。

1.2.4 MSCs與H9C2細胞共培養(yǎng)

1.2.4.1 H9C2細胞多柔比星損傷模型的建立取H9C2細胞懸液，每孔2 mL加入到30 mm共培養(yǎng)插件Millicell裝置中，置于培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)48 h。用終濃度為1μmol／L的多柔比星處理4 h，建立多柔比星損傷模型，更換為含 10%血清的DMEM-F12。

1.2.4.2 轉(zhuǎn)染MSCs 將第3代MSCs按2×105／mL接種于6孔板中，24 h后分為未轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染HGF-siRNA組及轉(zhuǎn)染陰性對照（NC）-siRNA組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4.3 建立MSCs與H9C2細胞共培養(yǎng)體系 將接種有H9C2細胞的Millicell裝置插入預(yù)先接種有MSCs的6孔板中，建立兩種細胞非直接接觸式的共培養(yǎng)體系。共分為4組：單獨H9C2細胞培養(yǎng)組、與MSCs共培養(yǎng)組、與HGF-siRNA-MSCs共培養(yǎng)組及與NC-siRNA-MSCs共培養(yǎng)組。

1.2.5 ELISA法檢測細胞上清HGF及TGF-β1含量

轉(zhuǎn)染成功后收集各組細胞上清液，按ELISA試劑盒操作說明加入適量標(biāo)準(zhǔn)品及樣品、檢測抗體、底物及終止液。酶標(biāo)儀檢測各孔光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各組細胞上清中HGF及TGF-β1的質(zhì)量濃度。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測HGF及TGF-β1的相對表達量 MSCs轉(zhuǎn)染siRNA 24 h后加入細胞裂解液與PMSF的混合液體，40 min后吸取裂解液，4℃12 000 r／min離心20 min，吸取上清。取等蛋白含量的樣品上樣。恒壓80 V電泳約30min后提高電壓至110 V。80 V恒壓下4℃轉(zhuǎn)膜2 h。室溫下5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入相應(yīng)的一抗（HGF稀釋濃度為1∶800，TGF-β1、GADPH稀釋濃度為1∶1 000），4℃過夜孵育。次日用HRP標(biāo)記的二抗（稀釋濃度均為1∶10 000）室溫下孵育1 h。洗膜后加入eECL顯色液，用Bio-Rad凝膠成像儀掃描拍攝蛋白條帶，測定各條帶灰度值，并以GAPDH為參照，計算和分析結(jié)果。

1.2.7 流式細胞術(shù)AnnexinⅤ／PI雙染法檢測H9C2細胞凋亡率 吹打各組Millcell膜上的H9C2細胞，離心后收集細胞至Ep管中，用PBS洗滌細胞2次。各組分別加入結(jié)合緩沖液500μL混勻懸浮細胞，加入Annexin V-FITC 5μL避光反應(yīng)，再加入PI 10μL避光4℃孵育5 min，流式細胞儀檢測分析。以AnnexinⅤ（＋）／PI（－）、AnnexinⅤ（＋）／PI（＋）兩個象限的細胞比例之和作為凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，重復(fù)測量資料采用一般線性模型方差分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SD大鼠MSCs的形態(tài)

MSCs懸液接種24 h后在電子顯微鏡下觀察，細胞開始貼壁生長。換液后可見貼壁的MSCs呈梭形或不規(guī)則形，單個或片狀生長。繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d后，貼壁細胞呈明顯的細胞集落，呈漩渦狀分布。傳代后，細胞形態(tài)較均一，呈長梭形，為纖維樣細胞外觀。傳至第3代時，細胞形態(tài)較穩(wěn)定。見圖1。

2.2 H9C2細胞形態(tài)

培養(yǎng)3 d的H9C2細胞呈長梭形，胞質(zhì)豐富，折光度好。見圖2。

2.3 HGF-siRNA轉(zhuǎn)染MSCs的效率

HGF-siRNA轉(zhuǎn)染24 h后，熒光電子顯微鏡下計算綠色熒光細胞所占比例，顯示MSCs的轉(zhuǎn)染效率可達（75.46±3.36）%。見圖3。

圖1 第3代骨髓間充質(zhì)干細胞（倒置顯微鏡×200）

圖2 H9C2細胞形態(tài)（倒置顯微鏡×200）

圖3 轉(zhuǎn)染HGF-siRNA的MSCs形態(tài)（熒光電子顯微鏡×200）

2.4 各組MSCs上清中HGF及TGF-β1含量

與未轉(zhuǎn)染組比較，轉(zhuǎn)染HGF-siRNA后的MSCs上清中的HGF含量明顯下降，而TGF-β1含量卻明顯增加，見表1。

表1 各組M SCs上清中HGF、TGF-β1的含量

2.5 各組MSCs中HGF及TGF-β1的表達量

提取各組細胞蛋白，用蛋白質(zhì)印跡法檢測HGF及TGF-β1的表達量。轉(zhuǎn)染HGF-siRNA后的MSCs兩種旁分泌因子的表達量與細胞上清中檢測結(jié)果一致。見圖4－圖6。

圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組MSCs旁分泌因子的表達

2.6 各組H9C2細胞的凋亡率

流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示，單獨培養(yǎng)的H9C2細胞凋亡率為（19.39±0.17）%，與MSCs共培養(yǎng)組為（6.65±0.4）%，與HGF-siRNA-MSCs共培養(yǎng)組為（18.54±0.64）%，與NC-siRNA-MSCs共培養(yǎng)組為（9.70±1.62）%。與HGF-siRNA-MSCs共培養(yǎng)24 h后的H9C2細胞凋亡率較與未轉(zhuǎn)染的MSCs共培養(yǎng)組及NC-siRNA-MSCs共培養(yǎng)組H9C2細胞凋亡率均明顯增加（P均＜0.05），但較H9C2單獨培養(yǎng)組細胞凋亡率下降（P＜0.05）。見圖7。

圖5 各組MSCs中HGF的表達

圖6 各組MSCs中TGF-β1的表達

圖7 流式細胞術(shù)檢測各組H9C2細胞的凋亡率

3 討論

MSCs作為一種多功能分化的干細胞，已被廣泛應(yīng)用于心臟疾病的治療。近年來，旁分泌機制在其中的作用越來越受到重視。已發(fā)現(xiàn)的MSCs旁分泌細胞因子有40余種，其可能作用機制包括血管生成、抑制心肌細胞的凋亡、抑制炎性反應(yīng)等［6］。

然而，大多研究都是針對單個因子的作用機制，在旁分泌細胞因子的微環(huán)境中，各因子間是否存在著相互作用呢？Kelly等［7］研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子受體1（tumor necrosis factor receptor type 1，TNFR1）通過減少MSCs的旁分泌途徑而削弱MSCs對心肌細胞的保護作用。Jayasankar等［8］研究表明，HGF可通過促進新生血管的生成和抑制心肌細胞的凋亡對心肌梗死后的心臟起修復(fù)作用。

我們的實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HGF-siRNA的MSCs中HGF的表達量較未轉(zhuǎn)染組及陰性對照組均明顯下降，表明轉(zhuǎn)染模型構(gòu)建成功。在HGF表達量減少的同時，發(fā)現(xiàn)TGF-β1的表達量與HGF呈相反趨勢。這一結(jié)果表明，MSCs旁分泌因子HGF對TGF-β1有抑制作用。

此外，本實驗采用Millicell裝置建立MSCs與多柔比星損傷的H9C2細胞的非直接接觸式共培養(yǎng)體系，保證MSCs旁分泌的各種細胞因子可以對H9C2細胞產(chǎn)生生物學(xué)影響。共培養(yǎng)24 h后采用流式細胞術(shù)AnnexinⅤ／PI雙染法檢測H9C2細胞凋亡率。結(jié)果顯示，與HGF-siRNA-MSCs共培養(yǎng)24 h后，H9C2細胞凋亡率較與未轉(zhuǎn)染的MSCs共培養(yǎng)組及NC-siRNA-MSCs共培養(yǎng)組H9C2細胞凋亡率明顯增加（P＜0.05），但較H9C2單獨培養(yǎng)組細胞凋亡率下降（P＜0.05）。這一結(jié)果證實了MSCs旁分泌HGF抑制多柔比星誘導(dǎo)的H9C2細胞凋亡作用的機制不僅與HGF本身對細胞凋亡的保護作用有關(guān)，還與其對TGF-β1的抑制作用密切相關(guān)。

綜上所述，MSCs旁分泌作用對多柔比星誘導(dǎo)的H9C2細胞損傷的修復(fù)作用除了眾多對細胞有保護作用的旁分泌因子外，細胞因子間的相互作用在其中也起到了至關(guān)重要的作用。這一實驗結(jié)果啟迪我們，在研究MSCs旁分泌機制時，應(yīng)將所形成的修復(fù)微環(huán)境看作一個整體，既研究各個旁分泌因子的單獨作用機制，也要注意發(fā)現(xiàn)因子間的相互作用，這樣才能更透徹地了解其機制，從而可通過抑制或促進某些旁分泌因子的表達而減少副效應(yīng)、提高移植安全性，使旁分泌的微環(huán)境能極大地發(fā)揮對心肌細胞的修復(fù)作用。

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Effect of hepatocyte grow th factor on doxorubicin-induced H9C2 cells apoptosis

LIU Ling-ling，ZHAO Long，LIXiao-li，ZHANG Ying-yu，WANG Hao，ZHOU Yan-fang，ZHANGGuo-hui
（Department of Cardiology，the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002，China）

Objective：To investigate the effect of hepatocyte growth factor（HGF）on doxorubicin（DOX）-induced H9C2 cells apoptosis.M ethods：The third generation ofmesenchymal stem cells（MSCs）were divided into three groups：cultured alone，HGF-siRNA-MSCs and NC-siRNA-MSCs.The concentration of HGF and transforming growth factorβ1（TGF-β1）weremeasured with both ELISA and Western-blot kit.H9C2 cellswere exposed to 1.0μmol／L doxorubicin for 4 hours.Then they were divided into four groups：cultured alone，co-cultured with MSCs，co-cultured with HGF-siRNA-MSCs and co-cultured with NC-siRNAMSCs.After 24 hours，the apoptosis rate was determined by flow cytometry（FCM）.Results：Compared with other groups，the concentration of TGF-β1in MSCs were significantly increased in the HGF-siRNAMSCs［（519.23±24.34）pg／mL］than cultured alone［（459.65±11.78）pg／mL］and NC-siRNA-MSCs［（459.33±11.78）pg／mL，P＜0.05］.The apoptosis rate of H9C2 cells was increased significantly in cocultured with HGF-siRNA-MSCs（18.54±0.64）%than co-cultured with MSCs（6.65±0.49）%and NC-siRNA-MSCs［（9.70±1.62）%，P＜0.05］.Conclusion：HGF prevented DOX-induced H9C2 cells apoptosis by inhibition of TGF-β1.

mesenchymal stem cells；paracrine；hepatocyte growth factor；transforming growth factor β1；apoptosis；doxorubicin

R329.2

A

1671－7783（2014）03－0221－05

10.13312／j.issn.1671-7783.y140033

劉玲玲（1988—），女，碩士研究生；張國輝（通訊作者），主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，E-mail：13338812776＠189.cn

2014－02－20 ［編輯］陳海林